實(shí)驗(yàn)用斑馬魚(yú)常見(jiàn)病原菌的分離檢測(cè)及其致病性研究.pdf

1、斑馬魚(yú)(Daniorerio，Zebrafish)，又稱(chēng)藍(lán)條魚(yú)、花條魚(yú)等，原產(chǎn)于南亞，是一種常見(jiàn)的熱帶觀賞魚(yú)。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代生命科技的不斷深入研究，斑馬魚(yú)作為一種新型的脊椎動(dòng)物模式生物，被廣泛地應(yīng)用于發(fā)育遺傳學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)及人類(lèi)疾病模型與新藥篩選等生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域，但其在細(xì)菌質(zhì)量控制方面與小鼠等法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物仍存在較大差距。在實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)條件下，病原菌是干擾斑馬魚(yú)健康狀態(tài)的重要病原，為了有效的預(yù)防與控制細(xì)菌性病原對(duì)斑馬魚(yú)健康狀

2、態(tài)的干擾，以確保其用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量，如何建立快速準(zhǔn)確的病原菌檢測(cè)方法已成為了實(shí)驗(yàn)用斑馬魚(yú)研究與應(yīng)用的重要課題之一。
　　本研究以本實(shí)驗(yàn)室（上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)室）自然發(fā)病且具有典型病癥的成年斑馬魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)研究樣本，并以該實(shí)驗(yàn)室健康斑馬魚(yú)以及選自上海南方模式研究中心、上海萬(wàn)商花鳥(niǎo)市場(chǎng)水族館的健康成魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，從病魚(yú)病灶組織及對(duì)照組相應(yīng)組織部位病原菌并進(jìn)行純培養(yǎng)后，共獲得8種優(yōu)勢(shì)菌株，并先后采用了形態(tài)觀察、生化鑒定及P

3、CR篩選的方法對(duì)所分離得到的8種細(xì)菌進(jìn)行了結(jié)果分析，得出結(jié)論1～8菌分別對(duì)應(yīng)為:假單胞菌屬、弧菌屬、溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、類(lèi)志賀鄰單胞菌、溫和氣單胞菌、泛菌屬及水生布戴約維采菌。進(jìn)一步針對(duì)該8種菌對(duì)健康斑馬魚(yú)進(jìn)行了致病性預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)3、4及6號(hào)菌表現(xiàn)出了較強(qiáng)的致病性，其感染的斑馬魚(yú)出現(xiàn)了腹部紅腫、尾部潰爛等較為嚴(yán)重的病理癥狀，且高濃度受試組均在24h內(nèi)全部死亡，3種菌均隸屬于氣單胞菌屬，由此可見(jiàn)氣單胞菌是引發(fā)實(shí)驗(yàn)室斑馬魚(yú)患病的主要

4、病原菌。
　　為了針對(duì)氣單胞菌屬細(xì)菌感染斑馬魚(yú)的致病性展開(kāi)進(jìn)一步研究，選取本實(shí)驗(yàn)室病魚(yú)體內(nèi)自行分離的4號(hào)嗜水氣單胞菌作為主要研究對(duì)象，并以購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)的編號(hào)為CGMCC1.2017的嗜水氣單胞菌作為陽(yáng)性對(duì)照菌株，針對(duì)嗜水氣單胞菌的氣溶素基因AHA_0438、胞外絲氨酸蛋白酶基因ASP、嗜水氣單胞菌保守基因gyrB、16SrDNA及氣單胞菌屬設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，電泳條帶位置均與預(yù)期結(jié)

5、果相符。挑選保守基因gyrB及16SrDNA的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)由NCBI的BLAST軟件對(duì)樣本測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，與GenBank中登錄的其它嗜水氣單胞菌的同源性在94％以上，利用MEGA5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)一步從分子水平上確認(rèn)了4號(hào)菌在氣單胞菌屬中的分型位置。此外，分別利用4號(hào)菌與陽(yáng)性對(duì)照菌株對(duì)健康斑馬魚(yú)進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)，以確定該兩種菌株的致病性強(qiáng)弱，并通過(guò)制作感染發(fā)病斑馬魚(yú)的組織切片，分析了感染嗜水氣單胞菌