副溶血弧菌感染斑馬魚的致病性及天然免疫應答研究.pdf

1、近年來隨著水產養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,水產動物病害問題也日益突出,副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，Vp)是引起多種海水魚類產生弧菌病的主要病原菌之一。由于水產動物重大病害頻頻發(fā)生給水產養(yǎng)殖業(yè)造成災難性的危害,使得免疫防治技術在魚病防治中呈現出日益廣闊的應用前景。因此,對魚類免疫機制的研究受到國內外學者的廣泛關注,且尤為重視天然免疫應答機制的研究。斑馬魚(Danio rerio)擁有完整的免疫系統(tǒng)(特異和天然免疫系統(tǒng)),

2、而且體型小,生命周期相對較短,易于實驗室養(yǎng)殖,便于開展大規(guī)模的試驗。斑馬魚是研究魚類傳染病的發(fā)病機理和免疫應答等基礎研究的最合適的模型動物。
　　本研究用副溶血弧菌的魚類致病株(Vp1.2164)和人類致病株(Vp17)為研究對象,以斑馬魚為感染動物模型,探討參與天然免疫應答的炎性細胞因子的變化規(guī)律。首先,系統(tǒng)比較了不同保藏方法對副溶血弧菌的毒力及生物學特性的保藏效果,為進行后續(xù)的相關研究提供了先決條件;其次,摸索其感染斑馬魚的有

3、效方式及其致病性,分析了不同感染方式下致病菌株對斑馬魚的致病性;最后,采用熒光定量 PCR技術檢測了斑馬魚在創(chuàng)傷感染和腹腔注射副溶血弧菌后,比較了2株副溶血弧菌創(chuàng)傷感染和腹腔注射感染斑馬魚后,IL-1β、IFN和TNF這3種炎性細胞因子的表達變化,得到以下主要結論:
　　1、本研究發(fā)現不同保藏方法,副溶血弧菌隨保藏時間的延長毒力有不同程度的下降。短期保藏,室溫斜面保藏比4℃斜面保藏效果好;長期保藏,-80℃甘油保藏和冷凍真空干燥保

4、藏效果較好,均為24個月以上;在-20℃,保護劑脫脂牛奶比甘油的效果要好,而在-80℃甘油保藏效果很好,說明甘油在超低溫下作為保護劑更適合副溶血弧菌。
　　2、本研究發(fā)現魚類致病株(Vp1.2164)與人類致病株(Vp17)對野生斑馬魚的毒力差異不顯著,兩者均出現典型的敗血癥癥狀,可在死亡魚的體內再分離到副溶血弧菌。組織病理切片顯示腸粘膜上皮細胞脫落、炎性水腫,脾臟充血,水腫。斑馬魚在肌肉注射、腹腔注射感染或者創(chuàng)傷皮膚后浸泡下易感

5、染副溶血弧菌,單純的浸泡不會被感染。相比而言,腹腔注射較易操作,是較優(yōu)的感染途徑。
　　3、本研究用魚類致病株(Vp1.2164)與人類致病株(Vp17)分別創(chuàng)傷感染和腹腔注射感染斑馬魚,利用熒光定量 PCR技術檢測 IL-1β、IFN和TNF三種炎性細胞因子的mRNA轉錄水平變化。結果表明:與對照相比,2株細菌不同感染條件下斑馬魚3種基因的表達量隨著感染時間延長均呈現出先升高后降低的變化特點。創(chuàng)傷感染 Vp1.2164和Vp17

6、的斑馬魚在8 h,IL-1β表達水平達到高峰,分別為對照組的125.7和100.9倍;TNF的表達水平也在8 h達到高峰,分別為對照組的249和55倍;而 IFN的表達量達最大值的時間在2株菌中出現差異,創(chuàng)傷感染Vp1.2164的斑馬魚在8 h,約為對照組的11.6倍,而感染 Vp17的斑馬魚在4小時,為對照組的10.4倍。腹腔注射感染 Vp1.2164和Vp17斑馬魚的IL-1β表達水平在4 h達到高峰,分別為對照組的56.5和48.

7、8倍;IFN表達水平也在4 h達到高峰,分別為對照組的11和2倍;而 TNF的表達量達最大值的時間在2株菌中出現差異,腹腔注射感染 Vp1.2164的斑馬魚在4 h,約為對照組的143倍,而感染 Vp17的斑馬魚在2小時,為對照組的46.2倍。結果顯示斑馬魚在感染后發(fā)生急性炎癥反應,且創(chuàng)傷后浸泡副溶血弧菌感染反應比腹腔注射慢,但8 h后感染魚發(fā)生了非常強烈的炎癥反應,3種炎癥相關因子表達水平比腹腔注射感染的魚高。
　　綜上所述,我