鉀素營(yíng)養(yǎng)對(duì)當(dāng)歸阿魏酸生物合成相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的：當(dāng)歸為臨床常用藥，阿魏酸是鑒別當(dāng)歸質(zhì)量?jī)?yōu)劣的主要指示性指標(biāo)之一。鉀素是植物體內(nèi)60多種酶的活化劑，鉀素的適量施用對(duì)作物的生長(zhǎng)、產(chǎn)量及品質(zhì)等均有積極影響。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于當(dāng)歸資源評(píng)價(jià)、生理特性、栽培育種、藥理藥化以及活性成分的分離提取等方面的研究已有大量報(bào)道，但基于與活性成分合成相關(guān)的功能基因的分子生物學(xué)和營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的研究，國(guó)內(nèi)外還鮮有報(bào)道。本研究旨在通過(guò)對(duì)當(dāng)歸阿魏酸生物合成中重要基因咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(COMT)、4-香豆

2、酸輔酶A連接酶基因(4CL)和阿魏酸-5-羥基化酶基因(F5H)的克隆和表達(dá)進(jìn)行初步分析，并進(jìn)行鉀素營(yíng)養(yǎng)調(diào)控，為探索當(dāng)歸阿魏酸生物合成途徑的分子機(jī)制和營(yíng)養(yǎng)調(diào)控效應(yīng)奠定基礎(chǔ)，為闡述當(dāng)歸品質(zhì)形成的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　方法：參考Genbank已發(fā)表的植物COMT、4CL、F5H基因保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，以當(dāng)歸葉片總 RNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法克隆出COMT、4CL和F5H基因核心片段后測(cè)序；以核心片

3、段序列設(shè)計(jì)基因特異性引物，利用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)法克隆出COMT和F5H基因兩翼序列；將核心序列和兩翼序列進(jìn)行電子拼接，設(shè)計(jì)基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物，擴(kuò)增出全長(zhǎng)
　　cDNA序列，并進(jìn)行測(cè)序，在Genbank中注冊(cè)。運(yùn)用SYBR Green熒光定量PCR方法，以當(dāng)歸18S基因?yàn)閮?nèi)參照基因，檢測(cè)COMT、4CL和F5H基因在當(dāng)歸不同組織，不同時(shí)期和不同鉀素處理中的表達(dá)量。
　　結(jié)果：(1)當(dāng)歸咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(

4、COMT)全長(zhǎng)的克隆及序列分析(登錄號(hào):KP188587):利用RT-PCR和RACE技術(shù)，得到了當(dāng)歸咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(COMT)全長(zhǎng)，該基因cDNA序列長(zhǎng)度為1436 bp，含有1個(gè)1098 bp的完整開(kāi)放閱讀框，編碼365個(gè)氨基酸。與 NCBI核酸和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中其他7種COMT基因的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果序列相似性較高(75％以上)。
　　(2)當(dāng)歸4-香豆酸輔酶A連接酶基因(4CL)核心片段的克隆及序列分析:利用RT-

5、PCR技術(shù)，得到了當(dāng)歸4-香豆酸輔酶A連接酶基因(4CL)核心片段，該基因片段cDNA序列長(zhǎng)度為514 bp，編碼170個(gè)氨基酸。與 NCBI核酸和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中其他7種4CL基因的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示序列相似性較高(79%以上)。
　　(3)當(dāng)歸阿魏酸-5-羥基化酶基因(F5H)全長(zhǎng)的克隆及序列分析(登錄號(hào):KP257433):利用RT-PCR和RACE技術(shù)，得到了當(dāng)歸阿魏酸-5-羥基化酶基因(F5H)全長(zhǎng)，該基因cDNA序列長(zhǎng)

6、度為1839 bp，含有1個(gè)1539 bp的完整開(kāi)放閱讀框，編碼512個(gè)氨基酸。與 NCBI核酸和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中其他7種F5H基因的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示序列相似性較高(70%以上)。
　　(4)不同鉀素水平對(duì)COMT、4CL和F5H基因表達(dá)的影響:熒光定量PCR結(jié)果表明三個(gè)基因隨著時(shí)間的延長(zhǎng)相對(duì)表達(dá)量均逐漸增高。COMT基因在前期根系表達(dá)量高于莖葉，但后期莖葉相對(duì)表達(dá)量增高并超過(guò)根系；在莖葉和根系中0 mmol/L K+處理對(duì)CO

7、MT的表達(dá)均有顯著地抑制作用。4CL基因在前期根系表達(dá)量高于莖葉，但后期莖葉相對(duì)表達(dá)量增高并超過(guò)根系；且在莖葉中0 mmol/L K+處理和12.0 mmol/L K+處理均會(huì)抑制這種基因的表達(dá)。F5H基因在莖葉的表達(dá)量要顯著高于根系表達(dá)量；在莖葉中，前期0 mmol/L K+處理和12.0 mmol/L K+處理均對(duì)F5H的表達(dá)表現(xiàn)出一定的抑制性，后期12.0 mmol/L K+處理的抑制性降低，但0 mmol/L K+處理仍表現(xiàn)出顯

8、著地抑制性，在根系中，12.0 mmol/L K+處理對(duì)F5H的表達(dá)表現(xiàn)出顯著地抑制性。
　　結(jié)論：(1)成功克隆出了當(dāng)歸COMT基因、F5H基因的全長(zhǎng)以及4CL基因的核心片段，并在Genbank中注冊(cè)，當(dāng)歸COMT全基因的登錄號(hào)為KP188587，當(dāng)歸F5H全基因的登錄號(hào)為KP257433；(2)通過(guò)研究鉀素水平對(duì)當(dāng)歸阿魏酸生物合成相關(guān)基因表達(dá)的影響表明，6.0 mmol/L K+處理無(wú)論在當(dāng)歸幼苗莖葉中還是在根系中均會(huì)對(duì)當(dāng)歸C