條斑紫菜TPS基因轉(zhuǎn)化水稻的研究.pdf

1、本研究目的是用條斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因（PyTPS）轉(zhuǎn)化水稻獲得轉(zhuǎn)基因植株，為篩選出耐鹽、抗旱的轉(zhuǎn)基因水稻植株與品系奠定基礎(chǔ)，主要研究結(jié)果如下:
　　 1、建立了水稻成熟胚愈傷組織為外植體的再生體系。
　　 日本晴、臺(tái)北309、中花11、旱稻297四個(gè)品種的種子在N6+2，4-D2mg/L+CH0.3g/L+脯氨酸2.878g/L培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)出淡黃色顆粒狀、結(jié)構(gòu)致密的愈傷，愈傷在RGH6培養(yǎng)基上可分化出不定芽，

2、分化率分別為78.8％，80.0％，70.6％和84.0％。在1/2MS+MET2mg/L培養(yǎng)基上可順利生根，形成完整的植株。
　　 2、建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得了抗卡那霉素的再生植株。
　　 在含卡那霉素、利福平與氯霉素三種抗生素的培養(yǎng)基上對(duì)農(nóng)桿菌株AGL1(pCAMBIA2300-PyTPS)進(jìn)行了嚴(yán)格的活化培養(yǎng)。利用針對(duì)目的基因的DNA引物（R1和3KpnI）、針對(duì)載體與目的基因的引物（35Sfor

3、和P4）及針對(duì)NPTⅡ基因的引物（NPTⅡ-F和NPTⅡ-R）對(duì)PyTPS基因的植物表達(dá)載體進(jìn)行了PCR鑒定，并分別擴(kuò)增出了1300bp、500bp與600bp的特異性片段.
　　 用100μmol/L乙酰丁香酮制備農(nóng)桿菌懸浮液，成熟胚誘導(dǎo)的愈傷繼代培養(yǎng)一周后，經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌懸浮液侵染20min，28℃黑暗中共培養(yǎng)3d，然后將愈傷組織接在篩選培養(yǎng)基上（N6+2，4-D2mg/L+麥芽糖20mmg/L+甘露醇36.43mg/L+Cef

4、400mg/L+Km100mg/L+瓊脂粉8.0g/LpH5.8），28℃暗培養(yǎng)20～25d后，進(jìn)行第一次篩選。進(jìn)行第二次篩選的培養(yǎng)基提高了卡那霉素濃度（N6+2，4-D2mg/L+麥芽糖20mmg/L+甘露醇36.43mg/L+Cef400mg/L+Km150mmg/L+瓊脂粉8.0g/LpH5.8）。大部分愈傷組織在篩選10d左右開(kāi)始褐化，然后在褐化組織的邊緣選取重新長(zhǎng)出乳白色愈傷抗性組織。
　　 經(jīng)2～3輪篩選后長(zhǎng)出的抗性

5、愈傷組織中挑選乳黃色致密性好的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)至28℃，16h/d光照條件下的分化培養(yǎng)基上，一般經(jīng)過(guò)20d，有綠點(diǎn)出現(xiàn)，30～40d后進(jìn)一步分化出小芽。當(dāng)小芽長(zhǎng)至約1cm時(shí)，移到生根培養(yǎng)基上，形成完整的植株。
　　 3、建立了PCR擴(kuò)增與鑒定體系，篩選出了水稻轉(zhuǎn)基因植株。
　　 用CTAB法提取水稻抗性植株與非轉(zhuǎn)基因植株的DNA,并用作模板，用持家基因的引物PT1、PT2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均獲得了350bp的目的條帶，也就是