淇河鯽CYP19基因的克隆、表達(dá)模式分析及免疫組化定位.pdf

1、與高等脊推動(dòng)物相比，魚類的性腺在胚胎發(fā)育早期更明顯地表現(xiàn)為雙向分化潛能，各種外部環(huán)境因素都可能在不同程度上影響魚類的性別分化。目前內(nèi)源性類固醇激素在魚類性腺分化中的重要作用已被普遍認(rèn)同，芳香化酶作為魚類體內(nèi)雌激素生物合成的關(guān)鍵酶和限速酶，該酶基因(CYP19)的表達(dá)與調(diào)控顯然在魚類性別決定與分化的分子機(jī)制中起著重要的作用。 淇河鯽是產(chǎn)于豫北淇河的中國地方性銀鯽種群，具有天然的三倍染色體系統(tǒng)和雌核發(fā)育繁殖方式，自然群體中存在著極少

2、數(shù)的雄性個(gè)體，且雄性個(gè)體具有正常的生精能力。因此，淇河鯽是典型的雌核發(fā)育兩性型種群。本研究通過對(duì)淇河鯽的性激素代謝基因——芳香化酶基因的克隆、時(shí)空表達(dá)與性腺細(xì)胞學(xué)定位的研究，從分子和細(xì)胞水平上探討了這一雌核發(fā)育兩性型種群性別分化的機(jī)制。 利用RT-PCR和3′-RACE技術(shù)，在淇河鯽卵巢和腦中分別克隆得到兩種不同類型CYP19 cDNA序列片段，其中CYP19a cDNA克隆片段長1468bp，含有240bp 3′-非翻譯區(qū)，編

3、碼409個(gè)氨基酸殘基；CYP19b cDNA克隆片段長2671bp，含有1385bp 3′-UTR，編碼428個(gè)氨基酸殘基；兩種CYP19 cDNA序列之間同源性為64.65％，氨基酸序列同源性為62.88％。系統(tǒng)進(jìn)化顯示，淇河鯽CYP19氨基酸序列分屬于魚類卵巢和腦芳香化酶基因的分支，與金魚的同源性最高。 以β-actin為內(nèi)參照，采用半定量RT-PCR方法檢測兩種CYP19基因在淇河鯽成體周年發(fā)育過程的三個(gè)時(shí)期(繁殖期、性腺

4、退化期、越冬期)五種組織(精巢、卵巢、腦、腎、肝)中的表達(dá)模式以及在胚胎發(fā)育過程七個(gè)階段(囊胚期、原腸胚、神經(jīng)胚、尾芽期、肌肉效應(yīng)期、孵出期、卵黃吸收期)的表達(dá)。結(jié)果顯示，兩種CYP19基因的表達(dá)模式有所不同。在繁殖期的各組織中CYP19均有表達(dá)，且表達(dá)活性卵巢≈腦>肝>精巢>腎；性腺退化期的肝、腎中均未見表達(dá)，其余三個(gè)組織的表達(dá)活性卵巢>腦>精巢；越冬期也僅在三個(gè)組織中有表達(dá)，表達(dá)活性精巢>卵巢>肝。CYP19b在繁殖期的表達(dá)活性最高

5、，除了腎其余四個(gè)組織中均有表達(dá)，且表達(dá)活性腦>卵巢>肝>精巢：性腺退化期與越冬期則僅見腦中有高表達(dá)。但總的來看，CYP19a主要表達(dá)于性腺組織(精巢和卵巢)中，CYP19b則主要表達(dá)于腦組織中。CYP19a從胚胎尾芽期出現(xiàn)，后呈遞增表達(dá)；CYP19b基因則至卵黃吸收期有突然的強(qiáng)表達(dá)。 SABC法對(duì)周年發(fā)育不同階段卵巢和精巢進(jìn)行的芳香化酶免疫細(xì)胞定位顯示，芳香化酶在卵巢的濾泡細(xì)胞、卵被膜、胞質(zhì)、核膜以及精巢的生殖細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和足