大蒜白斑病病原學(xué)、防治技術(shù)及其毒素致病機(jī)理研究.pdf

1、大蒜白斑病是近年來在湖北省當(dāng)陽地區(qū)發(fā)現(xiàn)的一種毀滅性病害。自2005年以來,該病在當(dāng)陽市10萬畝大蒜生產(chǎn)區(qū)大面積發(fā)生,年均減產(chǎn)20％～70％,嚴(yán)重影響了大蒜的產(chǎn)量和品質(zhì)。本文通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法將大蒜白斑病病原鑒定為茄匍柄霉Stemphylium solani。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對大蒜白斑病的病原學(xué)、防治技術(shù)以及毒素作用機(jī)理進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.從湖北省當(dāng)陽市大蒜種植基地采集具有典型癥狀的病葉,用常規(guī)組織分

2、離法獲得Stemphylium sp.菌株31個(gè),Alternaria sp.菌株33個(gè)。從每種菌中選取代表性菌株進(jìn)行致病性測定,結(jié)果表明,分別用Stemphylium sp.菌株DY-1、DY-5和DY-6的菌絲塊或分生孢子懸浮液接種,葉片發(fā)病率均為100％；而用Alternaria sp.菌株DY-P-1和DY-W-1的菌絲塊或分生孢子懸浮液接種大蒜葉片,均未表現(xiàn)任何癥狀。菌株DY-1、DY-5和DY-6的形態(tài)學(xué)特征相似,在PSA平

3、板上分生孢子褐色,具1-3個(gè)橫隔膜,中間隔膜顏色較深,有2-7個(gè)縱(斜)隔膜,大小29-58(45)×14-28(22)μm,長寬比為2:1；分生孢子梗頂端囊狀膨大,長達(dá)169μm；經(jīng)產(chǎn)孢表型培養(yǎng),可觀察到分生孢子以內(nèi)壁芽生式從產(chǎn)孢梗的頂端囊狀膨大體處產(chǎn)生；在自然寄主上,分生孢子大小為27-48(39)×15.30(21)μm；參照Simmons和Ellis等的分類方法,將菌株DY-1、DY-5和DY-6鑒定為茄匍柄霉S.solani。

4、rDNA-ITS序列分析結(jié)果表明,3個(gè)供試菌株的5.8S rDNA及兩側(cè)的ITS區(qū)序列與S.solani的同源性達(dá)99％。采用neighbor-ioining法構(gòu)建匍柄霉不同種的系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)菌株DY-1、DY-5和DY-6的序列與GenBank中S.solani(AF203449、AF203450)、S.nabarii(AY372679)和S.subglobuliferum(AY751454)的遺傳距離最近。
　　 2.采用

5、測定菌絲生長情況對大蒜白斑病菌生物學(xué)特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明,菌株DY-5在PSA平板上培養(yǎng),5～35℃范圍內(nèi)均能生長,最適生長溫度為20～30℃,pH值4～10均可生長,pn值為6～8時(shí)生長最佳；在Czapek液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),病菌對測試碳源中淀粉的利用效果最好,而對甘露醇利用最差,在測試氮源中,對谷氨酸利用最佳,對尿素利用最差；菌絲的最低致死溫度為55℃、10min。另外,采用臺(tái)盼藍(lán)染色法研究了大蒜白斑病菌的侵染特性,結(jié)果表明,接種2

6、 h后孢子即可萌發(fā);6h后可形成多根芽管(多至11根)；接種8h后芽管在氣孔附近分支形成侵染菌絲,從氣孔侵入到寄主細(xì)胞中；12h后侵染菌絲不斷分化可從多個(gè)氣孔侵入；24 h后病菌在氣孔中形成大量菌絲,侵入率顯著增加。
　　 3.研究了大蒜自斑病菌毒素的基本性質(zhì)及?；?。試驗(yàn)結(jié)果表明,PSB液體培養(yǎng)基是大蒜白斑病菌產(chǎn)毒的最佳培養(yǎng)基；毒素濾液經(jīng)甲醇或丙酮處理后,小分子物質(zhì)保留了毒素的致病活性；經(jīng)蛋白酶或高溫處理,毒素致病活性基本不變

7、:乙酸乙酯和正丁醇對毒素的萃取能力最強(qiáng),而氯仿和苯的萃取能力相對較弱；pH值對毒素濾液的致病活性有顯著影響,且隨pH值升高,其致病活性逐漸降低。另外,通過測定不同大蒜品種和寄主植物對S.solani的感病性及其對毒素的敏感性,可確定大蒜白斑病菌毒素為一種非寄主?；远舅?。
　　 4.采用薄層層析(TLC)和高效液相色譜(HPLC)法對大蒜白斑病菌毒素進(jìn)行分離純化,并結(jié)合化學(xué)鑒定、紫外可見吸收光譜(UV-VIS)、紅外光譜(IR)

8、、質(zhì)譜(MS)、元素分析以及核磁共振(NMR)等分析方法鑒定毒素結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,對24種TLC展開系統(tǒng)進(jìn)行篩選,得到其最佳展開劑為乙酸乙酯:石油醚:甲醇=4:1:0.35,可分離得到13個(gè)組分,其中組分4為主要致病組分；組分4經(jīng)HPLC純化制備,共可收集到100 mg棕紅色毒素純品,將其命名為SS-toxin。在SS-toxin的結(jié)構(gòu)鑒定中,通過化學(xué)反應(yīng)可初步判斷該毒素是一種酚類物質(zhì),而不是酯、生物堿、多肽、蛋白質(zhì)或氨基類化合物；毒素在

9、215 nm、264nm和458 nm處有紫外可見吸收峰；在紅外光譜中可看出,毒素結(jié)構(gòu)中有酚-OH(3400 cm-1)、-CH3(2946 cm-1、1449 cm-1、1395 cm-1)、芳香環(huán)(3092 cm-1、1595 cm-1)、-CO(1670 cm-1)和酮-C=O(1640 cm-1)存在的伸縮振動(dòng)；根據(jù)ESI-MS和元素分析結(jié)果得到SS-toxin的分子式為C16H1608(分子量336)；進(jìn)一步結(jié)合毒素的1H-N

10、MR譜,將SS-toxin初步鑒定為7-甲氧基-2-甲基-1,2,3,4-四氫-1,2,3,4,5-五羥基葸醌(7-methoxy-2-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-1,2,3,4,5-pentahydroxy anthraquinone)。
　　 5.為明確大蒜白斑病菌毒素的致病機(jī)理,研究了毒素組分SS-toxin對寄主植物生理活性、大蒜葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及葉片質(zhì)膜系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明,SS-mxin對抗、

11、感品種的濃度.劑量曲線分別為Y=0.0546X+0.2966(R2=0.9694,P<0.05)和Y=0.0871X+3.3893(R2=0.9774,P<0.05):毒素對大蒜根、芽生長及根尖有絲分裂均有抑制作用,其中對根、芽的抑制中濃度分別為64.9和178.5μgml-1；大蒜葉片經(jīng)毒素處理3d后,其葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量均有所下降,說明毒素與病害的癥狀發(fā)展有密切聯(lián)系；電鏡觀察結(jié)果表明,用毒素處理感病品種葉片2 h后,細(xì)

12、胞質(zhì)膜內(nèi)陷,細(xì)胞壁有輕微變形,6h后,線粒體脊數(shù)量減少,且出現(xiàn)空泡化,12 h后,葉綠體膜腫大,片層結(jié)構(gòu)出現(xiàn)解體,核膜部分消失,24 h后,細(xì)胞壁明顯斷裂,而其它結(jié)構(gòu)無明顯變化:用毒素處理抗病品種葉片,12 h后,質(zhì)膜開始出現(xiàn)內(nèi)陷,細(xì)胞壁腫脹變形,24 h后,少數(shù)線粒體空泡化,其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)無明顯變化,推測質(zhì)膜為SS-toxin的早期作用位點(diǎn)。采用兩相法制備大蒜抗、感品種葉片的質(zhì)膜微囊,并通過特異性酶抑制劑測得抗感品種質(zhì)膜的相對純度均在7

13、0％以上?？埂⒏衅贩N質(zhì)膜經(jīng)不同濃度毒素處理后,其H+-ATPase水解活力變化較為明顯,隨處理濃度升高,酶活性逐漸降低；用最高濃度200 gml-1毒素處理后,抗、感品種質(zhì)膜H+-ATPase的相對活性分別降低至56.4％和41.4％:另外,抗、感品種質(zhì)膜NADH氧化速率和Fe(CN)63-還原速率也均受抑制,以Fe(CN)63-作為電子受體時(shí),抗、感品種質(zhì)膜NADH相對氧化速率分別降低至45.8％和43.1％；以NADH作為電子供體時(shí)

14、,抗、感品種質(zhì)膜Fe(CN)63-相對還原速率分別下降至45.4％和18.9％。H+-ATP酶和標(biāo)準(zhǔn)氧化還原系統(tǒng)可能為SS-toxin在大蒜葉片細(xì)胞質(zhì)膜上的作用位點(diǎn)。
　　 6.2006～2008年對大蒜白斑病的流行規(guī)律和防治技術(shù)進(jìn)行研究,結(jié)果表明,2006-2007年病害于11月5日開始發(fā)生,至收獲期病指達(dá)60.6,其中11月、12月和次年3月為發(fā)病高峰期,病指增長率分別為37％、14％和13％,而2007-2008年病害的發(fā)

15、生推遲至11月24日,至收獲期病指僅為27.5。大蒜白斑病菌越夏研究結(jié)果表明,病殘?bào)w在溫室(25℃,30％RH)、冰箱(4℃,90％RH)、土表、土表下10 cm和土表下20 cm條件處理165 d后,菌絲體均能存活,存活率分別為40.0％、2.9％、25.7％、17.1％和5.7％,統(tǒng)計(jì)病殘?bào)w中分生孢子萌發(fā)率發(fā)現(xiàn),處理165 d后僅溫室和冰箱處理可觀察到分生孢子萌發(fā),萌發(fā)率分別為10.8％和5.7％。2006-2007年品比試驗(yàn)中,青

16、稈軟葉和軟軟葉抗病性最強(qiáng),其RAUDPC分別為10.0和10.4,而紅七星和溫二早最為感病,RAUDPC分別為67.3和64.4。2007-2008年供試品種中,自選-2、青稈軟葉和軟軟葉最為抗病,RAUDPC分別為2.7、3.4和3.9,而泰糯-1和山東濟(jì)南最感病,RAUDPC分別為33.0和32.8。2006-2007年種子處理苗期防病試驗(yàn)中,種子處理劑2.5％適樂時(shí)懸浮種衣劑(0.05 g a.i.kg-1)和50％福美雙可濕性粉

17、劑(1.25 g a.i.kg-1)拌種防效最好,其RAUDPC值分別為23.0和23.7;且2007-2008年調(diào)查仍以適樂時(shí)和福美雙的防效最好,其RAUDPC值分別為5.7和6.3。在PSA平板上測定9種殺菌劑對大蒜白斑病菌菌絲生長的抑制作用,以40％福星乳油的抑菌效果最好,EC50為0.4μgml-1；30％愛苗乳油、50％多菌靈可濕性粉劑、10％世高水分散粒劑和20.67％萬興乳油抑菌效果次之,其EC50分別為1.0μg ml-

18、1、1.4μgml-1、2.0μgml-1和2.7μgml-1。2006-2007年田間藥效試驗(yàn)中,40％福星乳油4000倍液和75％代森錳鋅可濕性粉劑1000倍液、2000倍液防效最好,其RAUDPC分別為11.5、13.0和14.6;2007-2008年,40％福星乳油4000倍液、75％代森錳鋅可濕性粉劑1000倍液和20.67％萬興乳油1000倍液的防效最好,RAUDPC分別為4.4、4.7和5.2,與對照藥劑甲基托布津存在顯著