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文檔簡介
1、小反芻獸疫(Peste des petits of ruminants,PPR)是由小反芻獸疫病毒(Pestedes petits of ruminants virus,PPRV)引起的危害山羊、綿羊等小反芻動物的重大疫病,為世界動物衛(wèi)生組織(The World Organisation for Animal Health)發(fā)布的A類烈性傳染病之一。近年來,PPR在我國周邊國家和地區(qū)及我國西藏自治區(qū)的肆虐對我國的養(yǎng)羊業(yè)構(gòu)成嚴重的威脅。<
2、br> 目前,我國西藏和新疆等西部地區(qū)采用經(jīng)Vero細胞傳代弱化的PPRV弱毒疫苗來預防PPR。但是,弱毒疫苗免疫小反芻獸之后無法與野毒感染相區(qū)別,不利于對PPR_的血清學監(jiān)控,更重要的是,PPRV弱毒疫苗熱敏感性強,限制了其在熱帶地區(qū)的應用。由于山羊痘(Goat pox,GP)與PPR宿主范圍一致,地理分布區(qū)域類似,GPV弱毒疫苗具有較強的熱穩(wěn)定性,并且隨著DNA重組技術的發(fā)展,山羊痘病毒(Goat pox virus,GPV)
3、在做為疫苗載體方面顯示出很強的優(yōu)越性,國外已有將PPRV保護性抗原基因F/H插入山羊痘病毒疫苗載體構(gòu)建二重疫苗進行免疫學研究的報道,并且顯示了良好的應用前景,但在國內(nèi)尚未見相關的報道。本研究將利用我國自行培育并得到廣泛應用的GPV弱毒株,分別構(gòu)建表達PPRV囊膜蛋白F和H的重組山羊痘病毒,并對其免疫原性進行了初步評估。
試驗一、小反芻獸疫重組山羊痘病毒的構(gòu)建。首先在已有載體pTK-gpt-gfp的基礎上,構(gòu)建了痘病毒晚期啟
4、動子p11驅(qū)動的、內(nèi)部核糖體進入位點(ires)介導的黃嘌呤鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(gpt)和綠熒光蛋白基因(egfp)串聯(lián)表達的轉(zhuǎn)移載體pTK-gpt-ires-egfp,將PPRV保護性抗原H、F基因片段分別克隆至pTK-gpt-ires-egfp,SalⅠ位點,獲得載體質(zhì)粒pTK-gig-PPRV-H、pTK-gig-PPRV-F;以我國自行培養(yǎng)并得到廣泛應用的山羊痘病毒(GPV)疫苗株為親本病毒,以山羊痘病毒(GPV)的復制非必需
5、區(qū)TK基因為靶點,通過質(zhì)粒pTK-gig-PPRV-H、pTK-gig-PPRV-F與GPV的同源重組,霉酚酸(Mycophenolic acid,MPA)藥物篩選,病毒蝕斑單克隆化后獲得完全純化的重組病毒rGPV-PPRV-F和rGPV-PPRV-H。以F、H基因的特異性引物PCR鑒定,表明基因片段分別在重組病毒中正確整合;經(jīng)Western-blot和IFA(間接免疫熒光)方法證實H蛋白、F蛋白分別在重組病毒中穩(wěn)定表達。
6、 試驗二、rGPV-PPRV-F、rGPV-PPRV-H重組病毒的初步免疫研究。以2×10。PFU的rGPV-PPRV-F、rGPV-PPRV-H皮內(nèi)注射免疫山羊,一免后第28天進行加強免疫,采血分離血清進行病毒中和試驗。結(jié)果表明,本研究構(gòu)建的小反芻獸疫重組山羊痘病毒rGPV-PPRV-H、rGPV-PPRV-F一次免疫山羊,3周后PPRV中和抗體轉(zhuǎn)陽率可達100%(6/6)、100%(3/3),二免后PPRV中和抗體效價進一步得到增強
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