豬肌肉生長抑素前肽基因定點誘變載體的構建和功能初步檢測.pdf

1、肌肉生長抑素（Myostatin，MSTN）又稱為生長分化因子8（GDF-8），是轉化生長因子β（TGF-β）超家族的重要成員，在調節(jié)動物肌肉含量上發(fā)揮負調控作用，因此，在醫(yī)學治療和畜牧業(yè)生產(chǎn)中，具有拮抗MSTN功能的生物因子有著良好的應用前景和較高的經(jīng)濟價值。MSTN前體經(jīng)體內蛋白酶水解后，產(chǎn)生N端的前肽分子和C端包含110個氨基酸殘基的活性分子。前肽分子通過與C端二聚體以非共價鍵結合抑制后者的生物學活性，是MSTN天然的拮抗分子。此

2、外，當MSTN前肽第76位天冬氨酸突變?yōu)楸彼幔―76A）后，在體內能抵抗BMP-1/TLD金屬蛋白酶的特異性切割作用，從而更有效地抑制C端二聚體的活性。
　　 本研究首先克隆了通城豬含有第一個內含子的MSTN前肽基因，構建了真核定點誘變載體，并通過轉染C2C12細胞驗證了載體表達的有效性。以通城豬血液樣品中提取的DNA作為模板，PCR擴增得到含第一個內含子的MSTN前肽基因，擴增產(chǎn)物進行克隆、測序。再將目的片段定向克隆到去除了

3、EGFP基因的pEGFP-N1表達載體中。通過定點誘變方法將前肽編碼序列第76位天冬氨酸突變?yōu)楸彼?，獲得了定點誘變載體pEGFP（-）-N1-ProMstnD76A，并瞬時轉染C2C12細胞。48h后，通過RT-PCR和Real-time PCR方法檢測目的基因的表達情況。
　　 結果表明：本研究成功克隆了通城豬含第一個內含子的MSTN前肽基因，并對該基因進行定點誘變修飾，構建了真核表達載體，轉染后其前體mRNA能在C2C12

4、細胞中進行正確剪接，目的基因mRNA表達水平較高。本研究為豬MSTN前肽基因在體內表達的研究奠定基礎，為MSTN前肽轉基因豬的制備提供了有用的基因分子材料。
　　 利用GST融合表達系統(tǒng)高效、快速地表達重組目的蛋白，本研究獲得了高純度的野生型和定點誘變型豬MSTN前肽蛋白分子，并初步驗證了其生物學活性。將大小為678bp的野生型和定點誘變型豬MSTN前肽cDNA片斷插入到原核表達載體pGEX-6p-1的多克隆位點中，重組質粒轉化

5、E．coli BL21后，在誘導溫度為37℃，IPTG終濃度為1mM下誘導表達6h。
　　 結果表明，表達產(chǎn)物融合蛋白GST-ProM和GST-ProMD76A主要以包涵體形式存在，融合蛋白經(jīng)蛋白變性、復性后，利用GSTrapTMFF親合層析柱進行純化。在PreScission蛋白酶作用下，特異性切除融合蛋白N端GST標簽蛋白，獲得了純化的重組蛋白ProM（SP-）和ProM（SP-）D76A。從1L菌液中分別獲得4.4mg和4