豬肌肉生長抑制素前肽基因定點(diǎn)突變載體的構(gòu)建及其原核表達(dá).pdf

1、肌肉生長抑素(Myostatin，MSTN)又稱生長分化因子8(GDF-8)，是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族的重要成員之一，它能夠抑制肌纖維的增長，因此對(duì)骨骼肌的生長發(fā)育起負(fù)調(diào)控作用。MSTN是一種分泌蛋白，主要由骨骼肌產(chǎn)生，并且以無生物活性的前體蛋白形式在血液內(nèi)循環(huán)，當(dāng)機(jī)體需要時(shí)，這種前體蛋白經(jīng)過兩次蛋白酶酶切加工，形成具有生物學(xué)活性的同源二聚體，并以濃度依賴性的方式對(duì)肌肉生長發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，限制肌纖維生長。豬MSTN前體蛋白由

2、375個(gè)氨基酸構(gòu)成，1-23為信號(hào)肽；24-266為前肽；267-375為成熟肽。前體蛋白運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)膜后首先被切除信號(hào)肽，然后在266位氨基酸處被金屬蛋白酶酶切去掉前肽(N端)，剩余109個(gè)氨基酸殘基的成熟肽(C端)通過其中9個(gè)半胱氨酸之間的二硫鍵形成同源二聚體，與細(xì)胞膜上的受體相互作用，通過3種Smad蛋白的介導(dǎo)將信號(hào)傳入細(xì)胞核，作用于靶基因的調(diào)控區(qū)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)骨骼肌數(shù)量和粗細(xì)的調(diào)節(jié)。鼠MSTN前肽的第76位天冬氨酸(Asp)(豬第

3、75位)是金屬蛋白酶家族BMP-1/TLD的特異性切割位點(diǎn)，MSTN前體被該蛋白酶處理后，能釋放本來與前肽非共價(jià)結(jié)合的C端二聚體，使C端二聚體能夠與相應(yīng)受體結(jié)合，激活下游信號(hào)通路。將該天冬氨酸突變?yōu)楸彼?Ala)后，突變的前肽仍能與C端二聚體結(jié)合形成潛在復(fù)合物，但這一突變卻使前肽能夠抵抗BMP-1/TLD蛋白酶家族成員的特異性切割作用從而有效地抑制C端二聚體的活性，降低MSTN對(duì)肌纖維的抑制作用進(jìn)而導(dǎo)致肌纖維數(shù)量的增多和肌纖維粗度的增

4、加。
　　 MSTN突變前肽的這種作用為醫(yī)學(xué)上治療肌肉萎縮和在畜牧業(yè)上提高動(dòng)物肌肉產(chǎn)量、培育動(dòng)物新品種提供新的研究方法和研究思路。因此，具有很好的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本研究以通城豬妊娠3個(gè)月的胚胎為材料，提取背最長肌總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此為模板PCR擴(kuò)增MSTN前肽序列并將其連接到原核表達(dá)載體pGEX-6p-1上。然后將該序列上第75位編碼天冬氨酸的密碼子變?yōu)楸彼崦艽a子(D75A)，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX-Pro

5、M(SP-)和pGEX-ProM(SP-)D75A。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21感受態(tài)細(xì)胞并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化pGEX-ProM(SP-)質(zhì)粒的E.coliBL21工程菌用0.6mmol/L的IPTG誘導(dǎo)5h表達(dá)量最高；而轉(zhuǎn)化pGEX-ProM(SP-)D75A的工程菌用1.2mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6h表達(dá)量最高。用GST-Trap蛋白純化系統(tǒng)純化回收總分子量約為51kD的融合蛋白(