氨基酸、多肽與蛋白質(zhì)

1、Biochemistry,張英Tel: 54237663E-mail: yingz@shmu.edu.cn,Welcome to,緒 論,Biochemistry: Neuberg ,1903Chemistry of life,,運(yùn)用化學(xué)和物理學(xué)及生物學(xué)原理和技術(shù)，主要是化學(xué)原理來研究生命現(xiàn)象的學(xué)科。生物化學(xué)研究的最終目的是在分子水平揭示生命活動的本質(zhì)，以及致病機(jī)制和治療原理。,一 、生物化學(xué)的內(nèi)容,1.敘述生化： 組

2、成與結(jié)構(gòu)2.動態(tài)生化： 代謝與調(diào)控3.功能生化： 結(jié)構(gòu)與功能,1. 敘述生化：組成與結(jié)構(gòu),生物體組成分（%） ： 水 蛋白質(zhì) 脂類 無機(jī)鹽 糖類 核酸55-67 15-18 10-15 3-4 1-2 微量三大營養(yǎng)素：

3、 蛋白質(zhì) 脂類 糖類,2. 動態(tài)生化： 代謝與調(diào)控,代謝：生物體與環(huán)境的物質(zhì)交換 體現(xiàn)生命 維持生命調(diào)控：為適應(yīng)環(huán)境的變化而改變代謝的機(jī)制,,,糖，蛋白質(zhì)，脂肪：氧化產(chǎn)生ATP核酸，膽固醇，磷脂，維生素：參與機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能,3. 功能生化： 結(jié)構(gòu)與功能,細(xì)胞水平和分子水平各異的生命決定于各異的結(jié)構(gòu)不同的功能具有不同的結(jié)構(gòu),分子生物學(xué) 蛋白

4、質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 核酸的結(jié)構(gòu)與功能,二、 生物化學(xué)的重要性,重要性在于生物化學(xué)的應(yīng)用性三多: 每年發(fā)表論文 諾貝爾獎獲得者 生化科學(xué)家生物學(xué)的普通語言──世界語言基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的關(guān)鍵學(xué)科,三、 生物化學(xué)的學(xué)習(xí)方法,1.代謝通路與酶相聯(lián)系2.前后內(nèi)容對照學(xué)3.整體內(nèi)容貫穿起來再復(fù)習(xí),三難：體內(nèi)參與反應(yīng)的物質(zhì)多，記憶難代謝反應(yīng)途徑多，功能各異，入門難大分子的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系

5、復(fù)雜，理解難,課程學(xué)習(xí)安排,本學(xué)期：生物化學(xué)（一）內(nèi)容：大分子結(jié)構(gòu)與功能 三大代謝 肝膽生化,下學(xué)年第一學(xué)期：生物化學(xué)（二）內(nèi)容：遺傳信息的流動、生物信息的傳導(dǎo)雙語教學(xué)*,課程進(jìn)度表網(wǎng)址：http://shmc.shmu.edu.cn/jxjd/,參考書,Harper’s Biochemistry 26th ed.Murray et al,2003Lehninger Principl

6、es of Biochemistry,4th ed.Dalid et al,2005Biochemistry，3rd ed.Donald Voet et al, 2003王鏡巖主編：《生物化學(xué)》3版，2002，高等教育出版社,氨基酸、多肽與蛋白質(zhì),第四章,Amino Acids，Peptides and Proteins,,1833年，Payen和Persoz分離出淀粉酶。1864年，Hoppe-Seyler從血液分離出血紅蛋白，

7、并將其制成結(jié)晶。19世紀(jì)末，F(xiàn)ischer證明蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的，并用氨基酸合成了多種短肽 。 1938年，德國化學(xué)家Gerardus J. Mulder引用“Protein” 一詞來描述蛋白質(zhì)。,,,,1951年, Pauling采用X（射）線晶體衍射發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)——α-螺旋(α-helix)。 1953年，F(xiàn)rederick Sanger完成胰島素一級序列測定。 1962年，John Kendrew和Max

8、Perutz確定了血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)。20世紀(jì)90年代以后，后基因組計(jì)劃。,什么是蛋白質(zhì)?,蛋白質(zhì)（protein）是由許多氨基酸（amino acids）通過肽鍵（peptide bond） 相連形成的大分子含氮化合物。,分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質(zhì)；細(xì)胞的各個部分都含有蛋白質(zhì)。含量高：蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)最豐富的有機(jī)分子，占人體干重的45％，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達(dá)80％。,蛋白質(zhì)的生物學(xué)重要性,1. 蛋白質(zhì)是

9、生物 體重要組成成分,1）作為生物催化劑（酶）2）代謝調(diào)節(jié)作用3）免疫保護(hù)作用4）物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和存儲5）運(yùn)動與支持作用6）參與細(xì)胞間信息傳遞,2. 蛋白質(zhì)具有重要的生物學(xué)功能,3. 氧化供能,氨基酸,第一節(jié),Amino Acids,一、組成人體的20種氨基酸均屬于L-α-氨基酸,存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸僅有20種，且均屬 L-氨基酸（甘氨酸除外）。,,H,氨基酸分類,疏水性氨基酸極性氨

10、基酸,中性氨基酸酸性氨基酸堿性氨基酸,脂肪族氨基酸芳香族氨基酸,(一)側(cè)鏈含烴鏈的氨基酸屬于非極性脂肪族氨基酸,二、20種氨基酸的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)及極性迥然不同,此類氨基酸有丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸。此類氨基酸在水溶液中溶解度小。,氨基酸分類（一）,,中性氨基酸有甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。,氨基酸分類（二）,(三)側(cè)鏈含芳香基團(tuán)的氨基酸是芳香族氨基酸,此類氨基酸有苯丙氨酸、酪氨酸和色

11、氨酸，其側(cè)鏈分別有苯基、酚基和吲哚基。,氨基酸分類（三）,,(四)側(cè)鏈含負(fù)性解離基團(tuán)的氨基酸是酸性氨基酸,此類氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸，其側(cè)鏈都含有羧基，均可解離而帶負(fù)電荷。,氨基酸分類（四）,(五)側(cè)鏈含正性解離基團(tuán)的氨基酸屬于堿性氨基酸,此類氨基酸有賴氨酸、精氨酸和組氨酸，其側(cè)鏈分別含有氨基、胍基和咪唑基，均可發(fā)生質(zhì)子化，使之帶正電荷。,氨基酸分類（五）,幾種特殊氨基酸,脯氨酸（亞氨基酸）,? 半胱氨酸,胱氨酸,修飾性氨基酸,羥

12、賴氨酸HO-Lys羥脯氨酸HO-Pro蘇氨酸、絲氨酸、酪氨酸磷酸化絲氨酸糖基化天冬酰胺糖基化,三、20種氨基酸具有共同或特異的理化性質(zhì),（一）氨基酸具有兩性解離性質(zhì),氨基酸是兩性電解質(zhì)，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。,pH=pI,pH>pI,pH<pI,氨基酸的兼性離子,陽離子,陰離子,等電點(diǎn) (isoelectric point, pI),在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性

13、離子，呈電中性。此時(shí)溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點(diǎn)。,（二） 氨基酸具有特征性的滴定曲線,甘氨酸滴定曲線,（三）含共軛雙鍵的氨基酸具有紫外吸收性質(zhì),色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280nm 附近。,大多數(shù)蛋白質(zhì)含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質(zhì)溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡便的方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,（四） α-氨基參與多種化學(xué)反應(yīng),Schiff堿,醛,氨基酸,（五）氨基酸的α-氨基與α-羧基共同參與

14、茚三酮反應(yīng),氨基酸與茚三酮水合物共熱，可生成藍(lán)紫色化合物，其最大吸收峰在570nm處。由于此吸收峰值與氨基酸的含量存在正比關(guān)系，因此可作為氨基酸定量分析方法。,（六）一個氨基酸的羧基可與另一個氨基酸的氨基反應(yīng)成肽,氨基酸的?-羧基與另一個氨基酸的?-氨基脫水縮合而生成二肽，多個氨基酸縮合生成多肽。,多肽和蛋白質(zhì)Polypeptides and Proteins,第二節(jié),一、多肽和蛋白質(zhì)是氨基酸的多聚體,（一）氨基酸是多肽與蛋白質(zhì)的基本

15、組成單位,氨基酸通過肽鍵(peptide bond) 相互連接而形成多肽和蛋白質(zhì)。肽鍵是由一個氨基酸的?-羧基與另一個氨基酸的?-氨基脫水縮合而形成的化學(xué)鍵。,+,,,甘氨酰甘氨酸,肽鍵,* 肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。,* 兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽……,* 肽鏈中的氨基酸分子因?yàn)槊撍s合而基團(tuán)不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。,* 由十個以內(nèi)氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopep

16、tide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。,氨基末端（amino terminal）或 N 末端：多肽鏈中有自由氨基的一端羧基末端（carboxyl terminal）或C 末端：多肽鏈中有自由羧基的一端,多肽鏈有方向性：,* 多肽鏈(polypeptide chain)是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結(jié)構(gòu)。,多肽鏈從氨基末端走向羧基末端。,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,（二）體內(nèi)存在多種重要的生物

17、活性肽,1.谷胱甘肽是體內(nèi)重要的還原劑,谷胱甘肽(glutathione, GSH),GSH過氧化物酶,GSH還原酶,NADPH+H+,NADP+,2.體內(nèi)有許多激素屬寡肽或多肽,3. 神經(jīng)肽是腦內(nèi)一類重要的肽,在神經(jīng)傳導(dǎo)過程中起重要作用的肽類稱為神經(jīng)肽(neuropeptide)。,? 組成蛋白質(zhì)的元素：,主要有C、H、O、N和S。有些蛋白質(zhì)含有少量磷或金屬元素鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬，個別蛋白質(zhì)還含有碘 。,二、蛋白質(zhì)的分子組成和

18、結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜,各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16％。,由于體內(nèi)的含氮物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主，因此，只要測定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質(zhì)的大致含量：,100克樣品中蛋白質(zhì)的含量 ( g % )= 每克樣品含氮克數(shù)× 6.25×100,1/16%,? 蛋白質(zhì)元素組成的特點(diǎn)：,(一)蛋白質(zhì)根據(jù)分子組成分為單純蛋白質(zhì)和結(jié)合蛋白質(zhì)兩類,根據(jù)蛋白質(zhì)組成成分，可分為：,結(jié)合蛋白質(zhì)及其輔基,根據(jù)蛋白質(zhì)形狀，可

19、分為：,根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，可分為：,超家族（super family）家族（family）亞家族（subfamily）,,形狀決定性質(zhì),(二)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)可區(qū)分為4個層次,,高級結(jié)構(gòu)或空間構(gòu)象(conformation),一級結(jié)構(gòu)(primary structure)二級結(jié)構(gòu)(secondary structure)三級結(jié)構(gòu)(tertiary structure)四級結(jié)構(gòu)(quaternary structu

20、re),三、氨基酸殘基的排列順序決定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu),肽鍵（主要化學(xué)鍵）二硫鍵,蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)(primary structure)是指蛋白質(zhì)分子中，從N端到C端的氨基酸排列順序。形成一級結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵：,一級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，但不是決定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的唯一因素。,,,,,目 錄,胰島素空間結(jié)構(gòu),四、多肽鏈中的局部特殊構(gòu)象是蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)(secondary structure)是指蛋白質(zhì)分

21、子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象 。,?-螺旋 ( ? -helix ) ?-折疊 ( ?-pleated sheet ) ?-轉(zhuǎn)角 ( ?-turn ) 無規(guī)卷曲 ( random coil ),蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要形式：,維系二級結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)鍵： 氫鍵,（一）肽鍵是一個剛性的平面,參與肽鍵的6個原子C?1、C、O、N、H、C?2位于同一平面，C?1和C

22、?2在平面上所處的位置為反式(trans)構(gòu)型，此同一平面上的6個原子構(gòu)成了所謂的肽單元 (peptide unit) 。,（二）?-螺旋是常見的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu),α-螺旋,連續(xù)排列的酰胺平面旋轉(zhuǎn)形成面螺旋右手螺旋酰胺平面與螺旋的長軸平行一個AA0.15nm,每3.6個為一圈(0.54nm)螺旋借助相鄰兩圈之-NH---CO-穩(wěn)定AA的側(cè)鏈伸向螺旋外側(cè)AA的大小和電荷可以影響螺旋的形成,（三）?-折疊使多肽鏈形成片層結(jié)構(gòu),,,

23、β-折疊,較為伸展,酰胺平面以鋸齒狀排列兩個片段可以是平行或反平行AA間距 平行 0.65nm 反平行 0.67nm只有片段間氫鍵,無片段內(nèi)氫鍵AA的側(cè)鏈伸向鋸齒狀結(jié)構(gòu)的外側(cè)小側(cè)鏈的AA有利于β-折疊的生成,（四）?-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲在蛋白質(zhì)分子中普遍存在,?-轉(zhuǎn)角,無規(guī)卷曲是用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結(jié)

24、構(gòu)。,,（五）模體是蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu),在許多蛋白質(zhì)分子中，可發(fā)現(xiàn)二個或三個具有二級結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近，形成一個特殊的空間構(gòu)象，并發(fā)揮專一的功能 ，被稱為模體(motif)。,超二級結(jié)構(gòu)：2個或2個以上二級結(jié)構(gòu)組合， αα，βαβ，ββ,模體(motif)： 數(shù)個至數(shù)

25、十個AA組成的具有自身相對獨(dú)立構(gòu)象和功能的小區(qū)域，模體可構(gòu)成結(jié)構(gòu)域，也可獨(dú)立存在。,,鈣結(jié)合蛋白中結(jié)合鈣離子的模體,鋅指結(jié)構(gòu)(zinc finger),各種蛋白激酶：以ATP為底物，其ATP結(jié)合模體相同。氨基酰~tRNA合成酶也以ATP為底物，其ATP結(jié)合模體與上大不相同。,幾種蛋白激酶C的模體,PS CRR1 CRR2 CaBS ABS DFG PBS

26、 21 22 207 23 305? H2N-RKGALR--CX2CX13CX2CX2VX41CX2CX13CX2CX2N----------■-----------COOH 21 22

27、 210 23 301/3 ?I/?Ⅱ H2N-RKGALR--CX2CX13CX2CX2VX41CX2CX13CX2CX2N----------■-----------COOH 21 22 219 23 310? H2N-RKGAL

28、R--CX2CX13CX2CX2VX41CX2CX13CX2CX2N----------■-----------COOH 143 22 86 23 298? H2N------RRGAIK--CX2CX13CX2CX2AX48CX2CX13CX2CX2N-----■-----------COOH

29、 155 21 135 23 301? H2N-------RQGAVR--CX2CX14CX2CX2VX48CX2CX13CX2CX2N--------■-----------COOH 15 22 91 23

30、 312? H2N-RRGARR--CX2CX13CX2CX2L-----■-----------COOH,幾種蛋白激酶C的模體,PS：假底物模體 RKGALR ，用于阻斷酶活性中心與底物的結(jié)合。 真底物 RXXSXRCRR1、CRR2：富含Cys，與激活劑結(jié)合，如：DG、PMA等。CaBS：鈣結(jié)合位點(diǎn)，受鈣離子調(diào)節(jié)ABS：

31、ATP結(jié)合模體DFG： Asp-Phe-Gly催化位點(diǎn)PBS：蛋白質(zhì)結(jié)合模體,,唾液酸轉(zhuǎn)移酶：50AA唾液酰模體，與底物CMP-SA結(jié)合。半乳糖轉(zhuǎn)移酶：CX5-6K(R)DKKND(G)，底物UDP-Gal 結(jié)合模體。弗林蛋白酶：定位于TGN，或細(xì)胞膜及胞外基質(zhì)，通過胞飲回TGN，有二個模體。 四肽模體：與胞飲有關(guān)，YKGL,不

32、同生物完全保守，普遍存在于通過胞飲作用循環(huán)于胞膜及高爾基體的膜蛋白上。 酸性膜體：膜上定位，CPSDSEEDEG,也存在于某些膜蛋白中?？赡芘c在膜上的定位有關(guān)。,模體與功能,相同的模體表現(xiàn)出相同的功能，因此，不同蛋白質(zhì)只要有部分相似功能就可能具有相似的膜體。具有不同功能的蛋白質(zhì)其模體不同，即使是同一類蛋白質(zhì)也表現(xiàn)出

33、不同的性質(zhì)。,（六）氨基酸殘基的側(cè)鏈可影響二級結(jié)構(gòu)的形成,蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是以一級結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的。一段肽鏈其氨基酸殘基的側(cè)鏈適合形成?-螺旋或β-折疊，它就會出現(xiàn)相應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)。這是氨基酸殘基的側(cè)鏈的相互作用可穩(wěn)定或去穩(wěn)定相應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)的原因。,一段肽鏈有多個酸性氨基酸殘基相鄰，則在pH7.0時(shí)這些殘基的游離羧基都帶負(fù)電荷，彼此相斥，妨礙α-螺旋的形成。同樣，多個堿性氨基酸殘基在一肽段內(nèi)，由于正電荷相斥，也妨礙α-螺旋的形成。,天冬酰胺、

34、亮氨酸的側(cè)鏈很大，也會影響α-螺旋形成。,脯氨酸的結(jié)構(gòu)不利于形成α-螺旋。,形成β-折疊的肽段要求氨基酸殘基的側(cè)鏈較小，才能容許兩條肽段彼此靠近。,五、多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步折疊形成蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)(tertiary structure)是指整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。,（一）三級結(jié)構(gòu)是指整條多肽鏈的空間分布,肌紅蛋白 (Mb) 的三級結(jié)構(gòu),,153 AA1 He

35、meA~H八段α-螺旋無-S-S-鍵功能：儲存O2,(二) 維持三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定主要依靠非共價(jià)鍵,蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定主要靠弱的相互作用力或稱非共價(jià)鍵、次級鍵，主要有氫鍵、 Van der Waals力、疏水作用、和離子鍵等。,纖連蛋白分子的結(jié)構(gòu)域,（三）三級結(jié)構(gòu)可含有功能各異的結(jié)構(gòu)域,大分子蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)?？煞指畛梢粋€或數(shù)個球狀或纖維狀的區(qū)域，折疊得較為緊密，各行使其功能，稱為結(jié)構(gòu)域(domain) 。,3-磷酸甘油醛脫氫酶

36、,(四) 根據(jù)結(jié)構(gòu)域可對蛋白質(zhì)進(jìn)行分類,根據(jù)結(jié)構(gòu)域可將球狀蛋白質(zhì)分為4類：反平行α螺旋結(jié)構(gòu)域（全α-結(jié)構(gòu)）平行或混合型β折疊片結(jié)構(gòu)域（α，β-結(jié)構(gòu)）反平行β折疊片結(jié)構(gòu)域(全β-結(jié)構(gòu))富含金屬或二硫鍵結(jié)構(gòu)域（不規(guī)則小蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)）,A. 全α-結(jié)構(gòu)域 B. 平行或混合型β折疊片結(jié)構(gòu)域C. 全β-結(jié)構(gòu)域 D. 富含二硫鍵結(jié)構(gòu)域,催化結(jié)構(gòu)域：功能相近者相似調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域：調(diào)節(jié)因子不同，故相似者甚少。結(jié)構(gòu)域的存在可很

37、好解釋多功能酶的作用機(jī)制。不同酶分子上存在著不同的結(jié)構(gòu)域，故功能不同。相同的結(jié)構(gòu)域存在于不同酶分子上，可推測其具有部分相同功能。,結(jié)構(gòu)域與功能,蛋白激酶,PKA PKG PKC EGFR 肌球蛋白 同源性 輕鏈激酶催化亞基 C

38、側(cè)催化域 N側(cè)催化域 +調(diào)節(jié)亞基 N側(cè)調(diào)節(jié)域 C側(cè)調(diào)節(jié)域 ATP結(jié)合區(qū)段，Asp-Phe-Gly催化位點(diǎn)，蛋白質(zhì)底物結(jié)合位點(diǎn),,,乙酰CoA羧化酶,生物素羧基結(jié)合蛋白生物素羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶別構(gòu)調(diào)節(jié)中心,乙酰轉(zhuǎn)移酶 轉(zhuǎn)酰基酶

39、 ? ?酮脂酰合成酶 ??酮脂酰還原酶? ?羥脂酰脫水酶 ?,? ?烯脂酰還原酶

40、 硫脂酶7個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成24萬大分子，以二分子聚合才能催化反應(yīng),脂肪酸合成酶,,結(jié)構(gòu)域與功能,功能相近者具有相似的結(jié)構(gòu)域不同結(jié)構(gòu)域具有不同功能多功能要求多結(jié)構(gòu)域,（五）分子伴侶參與蛋白質(zhì)的折疊,分子伴侶(chaperone)通過提供一個保護(hù)環(huán)境從而加速蛋白質(zhì)折疊成天然構(gòu)象或形成四級結(jié)構(gòu)。,* 分子伴侶可逆地與未折疊肽段的疏水部分結(jié)合隨后松開，如此重復(fù)進(jìn)行可防止錯誤的聚集發(fā)生，使肽鏈正確折疊。,* 分子伴侶也可

41、與錯誤聚集的肽段結(jié)合，使之解聚后，再誘導(dǎo)其正確折疊。,* 分子伴侶對于蛋白質(zhì)分子折疊過程中二硫鍵的正確形成起了重要的作用。,伴侶蛋白在蛋白質(zhì)折疊中的作用,亞基之間的結(jié)合力主要是疏水作用，其次是氫鍵和離子鍵。,六、某些蛋白質(zhì)具有四級結(jié)構(gòu)形式,蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。,有些蛋白質(zhì)分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)的亞基 (subunit)。,血紅蛋白

42、的四級結(jié)構(gòu),（二）亞基通過亞基間的相互作用聯(lián)系在一起,由2個亞基組成的蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)中，若亞基分子結(jié)構(gòu)相同，稱之為同二聚體(homodimer)，若亞基分子結(jié)構(gòu)不同，則稱之為異二聚體(heterodimer)。,（三）生物體內(nèi)有很多由多亞基組成的蛋白質(zhì),生物體內(nèi)許多蛋白質(zhì)往往由多個亞基組成，亞基之間憑借次級鍵形成蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)。,胰島素受體：由4個亞基組成(α2β2) ，α亞基與β亞基形成單體(monomer)，2個單體形成二聚體(di

43、mer)。,血紅蛋白的一、二、三、四級結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系Structure and Function of Proteins,第三節(jié),（一）一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ),一、一級結(jié)構(gòu)是高級結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ),天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、 β-巰基乙醇,,去除尿素、β-巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,,（二）一級結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)具有相似的高級結(jié)構(gòu)與功能,一級結(jié)構(gòu)相似的多肽或蛋白質(zhì)，其空間構(gòu)象以及功能也相似。,────────────

44、──────────── 氨基酸殘基序號 胰島素 ─────────────── A5 A6 A10 B30──────────────────────── 人

45、 Thr Ser Ile Thr 豬 Thr Ser Ile Ala 狗 Thr Ser Ile Ala 兔

46、 Thr Gly Ile Ser 牛 Ala Gly Val Ala 羊 Ala Ser Val Ala 馬 Thr Ser

47、 Ile Ala────────────────────────,促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和促黑激素(α-MSH, β-MSH)共有一段相同的氨基酸序列，因此，ACTH也可促進(jìn)皮下黑色素生成但作用較弱。,(三)氨基酸序列提供重要的生物化學(xué)信息,一些廣泛存在于生物界的蛋白質(zhì)如細(xì)胞色素c(cytochrome c)，比較它們的一級結(jié)構(gòu)，可以幫助了解物種進(jìn)化間的關(guān)系。,從細(xì)胞色素c的一級結(jié)構(gòu)看生物進(jìn)化

48、物種進(jìn)化過程中越接近的生物，細(xì)胞色素的一級結(jié)構(gòu)越相似,（四）重要蛋白質(zhì)氨基酸序列的改變可引起疾病,例：鐮刀形紅細(xì)胞貧血,這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，稱為“分子病”。,1. 肌紅蛋白/血紅蛋白含有血紅素輔基,二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)表現(xiàn)功能,血紅素結(jié)構(gòu),(一)血紅蛋白構(gòu)象改變引起功能變化,肌紅蛋白(myoglobin，Mb),肌紅蛋白是一個只有三級結(jié)構(gòu)的單鏈蛋白質(zhì)，有8段α-螺旋結(jié)構(gòu)。血紅素分子中的兩個丙酸側(cè)鏈以離子鍵形式與肽鏈中的

49、兩個堿性氨基酸側(cè)鏈上的正電荷相連，加之肽鏈中的F8組氨酸殘基還與Fe2+形成配位結(jié)合，所以血紅素輔基與蛋白質(zhì)部分穩(wěn)定結(jié)合。,血紅蛋白(hemoglobin，Hb),血紅蛋白具有4個亞基組成的四級結(jié)構(gòu)。Hb各亞基的三級結(jié)構(gòu)與Mb極為相似。Hb亞基之間通過8對鹽鍵，使4個亞基緊密結(jié)合而形成親水的球狀蛋白。,Hb與Mb一樣能可逆地與O2結(jié)合， Hb與O2結(jié)合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分?jǐn)?shù)（稱百分飽和度, pO2 ）隨O2濃度變化而

50、改變。,2. 血紅蛋白的構(gòu)象變化影響結(jié)合氧的能力,肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線,Hb與Mb的氧飽和曲線氧合Hb (Mb)與pO2的關(guān)系 Hb ：S狀曲線 Mb ：直角雙曲線 S狀曲線提供了一個靈敏可調(diào)的范圍(低pO2)和一個平坦不可調(diào)的范圍(高pO2)。,意義：肺部pO2較高，在一定范圍內(nèi)變化時(shí)，不至于太大地影響氧飽和度。(80-100)組織 pO2 較低，略有變 化，即可獲得飽和度的

51、變化，充分地獲氧。(20-40mmHg),結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 一級結(jié)構(gòu)決定構(gòu)象 空間構(gòu)象決定功能：?, ?亞基與Mb的三級結(jié)構(gòu)相似，結(jié)合O2。不同來源的Hb其三,四級結(jié)構(gòu)相似,運(yùn)輸O2Hb：四亞基，運(yùn)輸O2Mb：單亞基，儲存O2,X射線衍射圖： Hb與HbO2構(gòu)象不同 定義：某些因素作用于蛋白質(zhì)時(shí)，可結(jié)合至蛋白質(zhì)的某一部位，而使此蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，從而調(diào)節(jié)該蛋白質(zhì)的活性。Hb：別位蛋白O2：別位效應(yīng)劑

52、別位效應(yīng)具有普遍性,別位效應(yīng)(allosteric effect),協(xié)同效應(yīng)(cooperativity),一個寡聚體蛋白質(zhì)的一個亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應(yīng)。 如果是促進(jìn)作用則稱為正協(xié)同效應(yīng) (positive cooperativity)如果是抑制作用則稱為負(fù)協(xié)同效應(yīng) (negative coopera

53、tivity),,,血紅素與氧結(jié)合后，鐵原子半徑變小，就能進(jìn)入卟啉環(huán)的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動。,（二）蛋白質(zhì)構(gòu)象改變可導(dǎo)致構(gòu)象病,蛋白質(zhì)構(gòu)象疾?。喝舻鞍踪|(zhì)的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致疾病發(fā)生。,蛋白質(zhì)構(gòu)象改變導(dǎo)致疾病的機(jī)制：有些蛋白質(zhì)錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。,這類疾病包括：人紋狀體脊髓

54、變性病、老年癡呆癥、亨丁頓舞蹈病、瘋牛病等。,瘋牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一組人和動物神經(jīng)退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成全為β-折疊的PrPsc，從而致病。,瘋牛病,第四節(jié),蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)Chemical and Physical Properties of Proteins,,一、蛋白質(zhì)具有兩性電離性質(zhì),蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和

55、羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。,蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)( isoelectric point, pI),二、蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì),蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之間，其分子的直徑可達(dá)1～100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。,蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素：

56、顆粒表面電荷水化膜,水化膜,溶液中蛋白質(zhì)的聚沉,三、很多因素可引起蛋白質(zhì)變性,在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特定的空間構(gòu)象被破壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無序的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。,蛋白質(zhì)的變性(denaturation),造成變性的因素,如加熱、乙醇等有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子及生物堿試劑等 。,應(yīng)用舉例臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來消毒及滅菌。此外, 防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如

57、疫苗等）的必要條件。,若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性 。,蛋白質(zhì)的復(fù)性(renaturation),天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、 β-巰基乙醇,,去除尿素、β-巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,,在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。,蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅(jiān)固的凝塊，

58、此凝塊不易再溶于強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中。,蛋白質(zhì)沉淀,蛋白質(zhì)的凝固作用(protein coagulation),四、蛋白質(zhì)在紫外光譜區(qū)有特征性吸收峰,由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定。,五、蛋白質(zhì)呈色反應(yīng)可用于溶液蛋白質(zhì)測定,（一）蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生茚三酮反應(yīng),蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)(ninhydrin reac

59、tion) 。,（二）肽鏈中的肽鍵可與雙縮脲試劑反應(yīng),蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)(biuret reaction) 。雙縮脲反應(yīng)可用來檢測蛋白質(zhì)水解程度。,蛋白質(zhì)的分離、純化與序列分析Isolation, Purification and Sequencing of Proteins,第五節(jié),一、透析及超濾法可清除蛋白質(zhì)溶液中的小分子化合物,,利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分

60、子化合物分開的方法。,應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。,超濾法,透析(dialysis),二、丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀是常用的蛋白質(zhì)沉淀方法,使用丙酮沉淀時(shí)，必須在0～4℃低溫下進(jìn)行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,鹽析(salt precipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷

61、被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。,將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應(yīng)的抗原蛋白，并形成抗原抗體復(fù)合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白。,免疫沉淀法（immunoprecipitation）,三、利用電荷性質(zhì)可將蛋白質(zhì)采用電泳法進(jìn)行分離,蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負(fù)極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù), 稱為電泳(elct

62、rophoresis) 。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。等電聚焦電泳，通過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。雙向凝膠電泳，蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。,幾種重要的蛋白質(zhì)電泳：,四、應(yīng)用相分配或親和原理可將蛋白質(zhì)進(jìn)行層析分離,待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時(shí)，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在

63、兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的 。,層析(chromatography),離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。凝膠過濾(gel filtration)又稱分子篩層析，利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。,蛋白質(zhì)分離常用的層析方法,五、利用蛋白質(zhì)顆粒沉降行為不同可進(jìn)行超速離心分離,超速離心法(ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測定蛋白質(zhì)的分子量。,蛋白質(zhì)在

64、離心場中的行為用沉降系數(shù)(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系數(shù)與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關(guān) 。,因?yàn)槌两迪禂?shù)S大體上和分子量成正比關(guān)系，故可應(yīng)用超速離心法測定蛋白質(zhì)分子量，但對分子形狀的高度不對稱的大多數(shù)纖維狀蛋白質(zhì)不適用。,S,六、用化學(xué)或反向遺傳學(xué)方法可分析或演繹多肽鏈的氨基酸序列,分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成（離子交換層析）,測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基,把肽鏈水解成片段，分別

65、進(jìn)行分析,測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法,一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結(jié)果。,,,,,,氨基酸和肽的末端測定法,,通過核酸來推演蛋白質(zhì)中的氨基酸序列：,按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列,分離編碼蛋白質(zhì)的基因,測定DNA序列,排列出mRNA序列,,,,七、應(yīng)用物理學(xué)、生物信息學(xué)原理可進(jìn)行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測定或預(yù)測,通常采用圓二色光譜(circ

66、ular dichroism，CD)測定溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量。 ?-螺旋的CD峰有222nm處的負(fù)峰、208nm處的負(fù)峰和198nm處的正峰三個成分；而?-折疊的CD譜不很固定。,二級結(jié)構(gòu)測定,三維空間結(jié)構(gòu)測定X射線衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技術(shù)(nuclear magnetic resonance, NMR)是研究蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)最準(zhǔn)確的方法。,* 用分子力學(xué)、分子動力學(xué)的方法，根據(jù)物理化學(xué)