生物樣品前處理

1、生物樣品前處理,制作人：葉超,,,研究背景,,生物樣品種類,目錄,生物樣品儲存,生物樣品預(yù)處理,克服基質(zhì)效應(yīng)方法,生物樣品中藥物的分析測定是定量描述藥物體內(nèi)過程、獲得藥代參數(shù)的重要手段之一,,藥物濃度低（血液中藥物濃度、一般處于ng-pg級水平）,干擾組分多（血液成分及其復(fù)雜，包括基質(zhì)，內(nèi)源性物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物，含有數(shù)百乃至幾千種化合物）,藥物在體內(nèi)除原型還有代謝產(chǎn)物以及和內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合多種形式存在,,體內(nèi)生物樣品分析特點,體內(nèi)

2、生物樣品分析特點,生物樣品種類,,生物樣品種類選取的原則,能夠反應(yīng)出藥物濃度與藥物效應(yīng)之間的關(guān)系易于獲取便于處理、適合分析根據(jù)不同目的要求進行選取,,,,,血液（全血、血漿、血清）尿液、唾液、膽汁、乳汁、腦脊液、淋巴液、汗液等,非均勻生物樣品,心、肝、腎、脾、肺、腦、胃、腸、子宮、肌肉、皮膚等組織、器官,全血,血漿,血清,選擇血漿or 血清,選擇血漿理由：1)一般血漿中藥物濃度高于血清中藥物濃度2)血清形成過程中，血塊凝固時

3、，往往易造成吸附損失3)血清需要采血放置一段時間才可制得，對不穩(wěn)定的化合物影響較大4)血漿則可經(jīng)采血后立刻離心，分離血漿低溫保存,選擇血清理由：1)血漿中蛋白稍微多，可能會在SPE中產(chǎn)生堵塞柱子情況2)血漿中含有抗凝物質(zhì)（肝素或EDTA)可能會干擾化合物檢測,,,生物樣品的儲存,,一、冷藏或冷凍,采樣后除了立即分析外，為防止藥物發(fā)生變化，應(yīng)：短期保存，可4℃冷藏長期保存，可-20℃冷凍，不要反復(fù)凍融（大部分藥物）-80℃，

4、阿莫西林等抗生素,,二、有時，還應(yīng)考慮加入穩(wěn)定劑,酶抑制劑：一些酯類藥物，如普魯卡因、阿糖胞苷，易受血漿酯酶作用而發(fā)生水解，而應(yīng)在采樣后立即加入酶抑制劑如氟化鈉?？寡趸瘎阂恍┮籽趸奈镔|(zhì)，可加入VC或其它氧化劑。如血漿中的兒茶酚類藥物常規(guī)保存僅4周，若加入適量的VC，則能保存10周。,鹽酸班布特羅（前藥）,,體內(nèi)膽堿酯酶的作用下緩慢代謝,,阻斷水解,毒扁豆堿(膽堿酯酶抑制劑）,特布他林（代謝產(chǎn)物）,生物樣品的儲存和預(yù)處理(添加

5、酶抑制劑),生物樣品的儲存和預(yù)處理(避光）,生物樣品的儲存和預(yù)處理(PH值和溫度）,,,生物樣品預(yù)處理目的,,,,1,2,3,將藥物從綴合物（尿）或結(jié)合物中釋放出來，以測定藥物濃度,將微量藥物從復(fù)雜介質(zhì)中純化、富集起來,防止分析儀器的污染，提高測定靈敏度和選擇性,生物樣品常用的處理方法,,,,,,,,,,,,,,,,一,二,三,沉淀蛋白(PPT),液液萃取(LLE),固相萃取(SPE),主要考慮生物樣品的種類、被測藥物的性質(zhì)和測

6、定方法三個方面的問題：,沉淀蛋白,通過沉淀蛋白質(zhì)可以使結(jié)合的藥物釋放出來，達到對待測組分的提純和純化,有機溶劑沉淀法,加入中性鹽,有機酸,加入鋅鹽或銅鹽沉淀劑,酶解法,有機溶劑沉淀法,,原理,加入水溶性有機溶劑，可使蛋白質(zhì)的分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化,,常用有機溶劑種類,乙腈、甲醇、丙酮、乙醇、四氫呋喃等,,操作實例,50μl 血漿+150μl甲醇 渦旋1min 3500rpm離心10min

7、 取上清液進樣分析,有機溶劑沉淀法實例,奧氮平,有機溶劑沉淀法,,血漿或血清與有機溶劑的體積比為1:1~3，就可以將90%以上的蛋白質(zhì)除去，采用低溫低速3500r/min離心10min便可將析出的蛋白質(zhì)完全沉淀。,經(jīng)驗總結(jié),,優(yōu)點,操作簡單，快速，精密度好，為方法開發(fā)中優(yōu)先考慮使用的，特別在LC-MS方法中幾乎使用于所有小分子化合物，無論其極性大小化合物回收率接近100%，幾乎所有小分子化合物都被提取，尤其適用于代謝產(chǎn)物鑒定,

8、,缺點,只適用于樣品中濃度較高的藥物測定；樣品處理后仍然存在很多干擾物質(zhì)，對結(jié)果產(chǎn)生干擾；殘余的雜質(zhì)會堵塞色譜柱，污染儀器,加入強酸,,原理,當PH低于蛋白質(zhì)等電點時，蛋白質(zhì)以陽離子形式存在，加入強酸，可與蛋白質(zhì)陽離子形成不溶性鹽沉淀。,,常用有機溶劑種類,10%三氯醋酸， 10%高氯酸等,,經(jīng)驗總結(jié),血清與強酸的比例為1:0.6混合，高速離心，就可除去蛋白質(zhì)在酸性條件下分解的藥物不宜本法除蛋白,頭孢地尼,內(nèi)標 頭孢克洛,加入強酸

9、實例,酶解法,,原理,在測定酸不穩(wěn)定及蛋白結(jié)合牢固的藥物，需用酶解法，最常用的酶是蛋白水解酶的枯草菌溶素，,,優(yōu)點,可避免某些藥物在酸、及高溫條件下降解：對與蛋白質(zhì)結(jié)合牢固的藥物（保泰松、苯妥英鈉)，可顯著改善回收率,加入中性鹽,,原理,加入中性鹽，使溶液的粒子強度發(fā)生變化。中性鹽能將與蛋白質(zhì)水合的水置換出來，從而使蛋白質(zhì)脫水而沉淀。,,常用中性鹽種類,飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽、枸櫞酸鹽,,操作實例,血清和飽和硫酸銨的比例為1:

10、2，混合，離心10000r/min 1-2min，即可除去90%以上蛋白質(zhì),生物樣品常用的處理方法,,,,,,,,,,,,,,,,一,二,三,沉淀蛋白(PPT),液液萃取(LLE),固相萃取(SPE),主要考慮生物樣品的種類、被測藥物的性質(zhì)和測定方法三個方面的問題：,液-液提取方法（LLE）,可以根據(jù)藥物分子與基質(zhì)之間的極性差異，使用適當?shù)挠袡C溶劑提取藥物，可一次性除去大部分雜質(zhì),LLE方法需是考慮的問題,,一、溶劑的選擇原則,相

11、似相溶原理進行選用沸點低、易于揮散和濃集無毒、不易乳化具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和惰性和水不相溶,常用液-液萃取溶劑,,正己烷叔丁基甲醚乙醚乙酸乙酯正丁醇,,極性增加,,二、有機溶劑和水相的體積比,有機溶劑相和水相的體積比1:1或2:1，由實際情況決定，文獻中有10:1以上,,三、水相的PH值,對于堿性藥物，最佳PH要高于藥物PKa1-2單位，對于酸性藥物，最佳PH要低于PKa1-2單位，使藥物分子以非電離的形式存在，從而

12、更易溶于有機溶劑中,操作實例,LLE方法操作實例,,,萃取劑,LLE方法操作實例,待測藥物：氯雷他定,內(nèi)標：地西泮,LLE方法總結(jié),,優(yōu)點,選擇性高，可除去大部分雜質(zhì)對有機溶劑蒸發(fā)后復(fù)溶，可以對樣品進行濃縮樣品較干凈，對儀器污染小不同PH體系中與不同的萃取劑組合，可控制回收率，并降低基質(zhì)效應(yīng),,缺點,操作繁瑣，不能自動化易乳化一般提取回收率較低不適用于極性大或者易揮發(fā)的化合物的提取由于需要揮發(fā)有機溶劑，對于熱不穩(wěn)定的化合物

13、也不太適合，容器吸附的化合物也有一定的困難對于極性相差較大的化合物同時提取困難,生物樣品常用的處理方法,,,,,,,,,,,,,,,,一,二,三,沉淀蛋白(PPT),液液萃取(LLE),固相萃取(SPE),主要考慮生物樣品的種類、被測藥物的性質(zhì)和測定方法三個方面的問題：,固相萃取技術(shù)(SPE),固相萃取(Solid Phase Extraction，簡稱SPE)是從八十年代中期開始發(fā)展起來的一項樣品前處理技術(shù)。由液固萃取和液相色

14、譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來。主要通過固相填料對樣品組分的選擇性吸咐及解吸過程，實現(xiàn)對樣品的分離，純化和富集。主要目的在于降低樣品基質(zhì)干擾，提高檢測靈敏度,固相萃取技術(shù)基本原理和方法,,基本原理,采用選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對樣品進行富集、分離、純化，是一種包括液相和固相的物理萃取過程；也可以將其近似地看作一種簡單的色譜過程,,,較常用的方法是使液體樣品通過一吸附劑，保留其中被測物質(zhì)，再選用適當強度溶劑沖去雜質(zhì)，然后用少量良溶劑洗脫被測物質(zhì)

15、，從而達到快速分離凈化與濃縮的目的也可選擇性吸附干擾雜質(zhì)，而讓被測物質(zhì)流出,基本方法,固相萃取分離類型,,反相固相萃取,硅膠上鍵合C18，C8，C2，苯基，腈基流動相極性大于固定相，適合分離中小極性的化合物的萃取疏水性相互作用,,正相固相萃取,無鍵合硅膠、或硅膠上鍵合氰基、NH2、二醇基流動相極性小于固定相，適合于極性的化合物的萃取親水性相互作用,,離子交換萃取,硅膠基質(zhì)的離子交換官能團，季胺，氨基、二氨基、苯磺酸基、羧基帶

16、有電荷的化合物靠靜電吸引到帶有電荷的吸附劑表面,,吸附型萃取,采用極性較強的硅膠、硅藻土和氧化鋁等吸附劑,固相萃取和HPLC相比的特點,SPE也是一個柱色譜分離過程，分離機理、固定相和溶劑的選擇等方面與高效液相色譜（HPLC）有許多相似之處。 但是SPE柱的填料粒徑（>40µm）要比HPLC填料（3~10µm）大。由于短的柱床和大的粒徑，SPE柱效比HPLC色譜柱低得多。 因此，用SP

17、E只能分開保留性質(zhì)有很大差別的化合物。與HPLC的另一個差別是SPE柱是一次性使用。,固相萃取操作一般有五步：活化——甲醇/乙腈 潤濕小柱，活化填料；平衡——水或適當緩沖液沖洗平衡小柱；上樣——將樣品轉(zhuǎn)移上柱，抽去廢液；淋洗——水或緩沖液最大程度洗去干擾物；洗脫——用小體積的溶劑將被測物質(zhì)洗脫下來并收集。,親脂型鍵合硅膠SPE柱實驗步驟,,,,平衡,上樣,淋洗,洗脫,基質(zhì),雜質(zhì),目標化合物,常見的固相萃取柱,普通C18固相萃

18、取固相萃取材料耐受PH范圍窄（2-7.5）硅膠鍵合吸附劑的表面存在未鍵合的硅羥基，對堿性化合物的保留較強，用硅膠鍵合吸附劑處理堿性化合物，回收率通常較低對極性化合物保留差,HLB(Hydrophilic-lipophilic Balance Copolymer)PH1-14范圍內(nèi)穩(wěn)定無裸露的硅醇羥基親水物質(zhì)和親脂物質(zhì)具有均衡的保留能力，覆蓋了非極性、弱極性、極性化合物,,Oasis HLB柱（聚合物基質(zhì)）,親水親脂柱的優(yōu)點

19、親水基團（吡咯烷酮基團）和疏水基團（二乙烯基苯）,對極性化合物和非極性化合物均有較好的保留，具有親水親脂平衡的特性具有水可潤濕性，填料經(jīng)活化后，即使柱床干涸，吸附劑對目標物的保留也不會發(fā)生變化有機聚合物而非硅膠，在pH 0-14 的范圍內(nèi)表現(xiàn)穩(wěn)定有機聚合物基質(zhì)的吸附劑，不存在次級相互作用，用于堿性化合物能夠得到滿意的結(jié)果,Oasis HLB柱（聚合物基質(zhì)）,Oasis HLB柱（聚合物基質(zhì)）,離子交換與反相模式混合的固相萃取,,

20、強陽離子和反相雙重保留基質(zhì)常用于提取凈化生物基質(zhì)中的弱堿性化合物酸性環(huán)境中含氮堿性基團與磺酸基結(jié)合酸性藥物呈分子狀態(tài)發(fā)生反相結(jié)合作用,反相作用,離子交換,離子交換與反相模式混合的固相萃取,固相萃取法方法總結(jié),SPE優(yōu)點：1、不發(fā)生乳化；2、適應(yīng)的極性范圍較廣；3、提取效率高；4、方便快速；5、溶劑用量少；6、易于自動化；7、室溫下操作，尤其適于處理揮發(fā)性及對熱不穩(wěn)定的藥物。 目前，商品化固相提取小柱（ca

21、rtridge）的應(yīng)用已比較普遍。,最大的缺點： 貴 20多元/支,三種方法的比較：,樣本較干凈基質(zhì)效應(yīng)低,操作迅速適合各種性質(zhì)化合物,基質(zhì)效應(yīng)及其影響,基質(zhì)效應(yīng)（martix effect）：定義：樣品測試過程中，由于待測物以外的的其它物質(zhì)存在，直接或間接影響待測物相應(yīng)的現(xiàn)象如測定血液中的紅霉素濃度為例，除了紅霉素之外的蛋白、磷脂、及其它內(nèi)源性物質(zhì)為基質(zhì)共流成分會改變待測化合物的離子化效率，引起對待測化合物監(jiān)測信號的抑

22、制或提高,基質(zhì)效應(yīng)評價方法,柱后灌注法提取后加入法（相對基質(zhì)效應(yīng)評價）,MF：基質(zhì)效應(yīng)因子MF=Set 2/Set 1IS-normalized MF :內(nèi)標歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子,Set 2: 提取空白生物基質(zhì)，濃縮復(fù)溶形成溶液，將待測物與內(nèi)標加入此溶液中。Set 1: 將待測物和內(nèi)標溶于非生物基質(zhì)的空白溶液， 如: 用甲醇、 乙腈等溶劑直接配制待測物或內(nèi)標的溶液,基質(zhì)效應(yīng)的消除,（1）選擇合適的樣品預(yù)處理方法蛋白沉淀法 處

23、理后的樣品不是很干凈、內(nèi)源性物質(zhì)較多，從而產(chǎn)生較強的基質(zhì)效應(yīng)液液提取法和固相萃取法處理后的樣品較潔凈，絕大多數(shù)內(nèi)源性物質(zhì)易被去除，但操作復(fù)雜，可能帶來提取回收率低其它問題,基質(zhì)效應(yīng)的消除,（2）改變被測物的色譜分離條件優(yōu)化色譜條件使得待測物與內(nèi)源性雜質(zhì)分離內(nèi)源性雜質(zhì)一般極性大，反相液相中保留時間短適當延長待測組分的保留時間，有利于減少基質(zhì)效應(yīng)對測定的影響,基質(zhì)效應(yīng)的消除,（3）采用性質(zhì)相近或穩(wěn)定同位素內(nèi)標同位素標記物為最為理