普通生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、生物化學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)課件,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 于樂軍,目錄,實(shí)驗(yàn)一 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技能培訓(xùn) 實(shí)驗(yàn)二 蛋白質(zhì)部分性質(zhì)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)三 Folin-wu法定量測(cè)定血糖的含量 實(shí)驗(yàn)四 Folin-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 實(shí)驗(yàn)五 氨基酸的紙層析 實(shí)驗(yàn)六 醋酸纖維薄膜電泳血清蛋白 實(shí)驗(yàn)七 胰蛋白酶的活力測(cè)定 實(shí)驗(yàn)八

2、酵母RNA的提取及鑒定 實(shí)驗(yàn)九 DNA的定量測(cè)定 實(shí)驗(yàn)十 水果中維生素C的定量測(cè)定 實(shí)驗(yàn)十一 聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳牛血清,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技能培訓(xùn),中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,通過生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)應(yīng)該做到：,⑴ 學(xué)習(xí)設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)的基本思路，掌握各個(gè)實(shí)驗(yàn)的基本原理，學(xué)會(huì)嚴(yán)密地組織自己的實(shí)驗(yàn)，合理地安排實(shí)驗(yàn)步驟和時(shí)間。⑵ 訓(xùn)練實(shí)

3、驗(yàn)的動(dòng)手能力，學(xué)會(huì)熟練地使用各種生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器。⑶ 學(xué)會(huì)準(zhǔn)確翔實(shí)地記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和數(shù)據(jù)的技能，提高實(shí)驗(yàn)報(bào)告的寫作能力，能夠整齊清潔地進(jìn)行所有的實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致的科學(xué)作風(fēng)。⑷ 掌握生物化學(xué)的各種基本實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，為今后參加科研工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,實(shí)驗(yàn)室規(guī)則,⑴ 實(shí)驗(yàn)前必須認(rèn)真預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，明確本次實(shí)驗(yàn)的目的和要求，掌握實(shí)驗(yàn)原理。⑵ 實(shí)驗(yàn)時(shí)自覺遵守實(shí)驗(yàn)室紀(jì)律，保持室內(nèi)安

4、靜，不大聲說(shuō)笑和喧嘩。⑶ 實(shí)驗(yàn)過程中要聽從教師指導(dǎo)，認(rèn)真按照實(shí)驗(yàn)步驟和操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若想改進(jìn)和設(shè)計(jì)新的實(shí)驗(yàn)方法，必須取得教師的同意。實(shí)驗(yàn)時(shí)認(rèn)真進(jìn)行實(shí)驗(yàn)記錄，實(shí)驗(yàn)完畢及時(shí)整理數(shù)據(jù)，按時(shí)上交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,⑷ 實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、稱量臺(tái)、藥品架、水池以及各種實(shí)驗(yàn)儀器內(nèi)外都必須保持清潔整齊，藥品稱完后立即蓋好瓶蓋放回藥品架，嚴(yán)禁瓶蓋及藥勺混雜，切勿使藥品（尤其是NaOH）灑落在天平和實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上，

5、毛刷用后必須立即掛好，各種器皿不得丟棄在水池內(nèi)。 ⑸ 配制試劑按實(shí)驗(yàn)實(shí)際使用量配制，多余的重要試劑和各種有機(jī)試劑要按教師要求進(jìn)行回收；昂貴試劑需要回收，不得丟棄。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,⑹ 配制的試劑和實(shí)驗(yàn)過程中的樣品，尤其是保存在冰箱和冷室中的樣品，必須貼上標(biāo)簽、寫上品名、濃度、姓名和日期等，放在冰箱中的易揮發(fā)溶液和酸性溶液，必須嚴(yán)密封口。⑺ 強(qiáng)酸強(qiáng)堿以及其他實(shí)驗(yàn)廢液必須倒入廢液桶。電泳后的凝膠和

6、各種廢物不得倒入水池，只能倒入廢物桶。⑻ 使用貴重精密儀器應(yīng)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。使用分光光度計(jì)時(shí)不得將溶液灑在儀器內(nèi)外和地面上。儀器發(fā)生故障應(yīng)立即報(bào)告教師，未經(jīng)許可不得自己隨意檢修。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,⑼ 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙、飲水和進(jìn)食， 嚴(yán)禁用嘴吸移液管和虹吸管。易燃液體不得接近明火和電爐，凡產(chǎn)生煙霧、有害氣體和不良?xì)馕兜膶?shí)驗(yàn)，均應(yīng)在通風(fēng)條件下進(jìn)行。⑽ 實(shí)驗(yàn)完畢必須及時(shí)洗凈并放好各種玻璃儀器，插好

7、自動(dòng)部分收集器上的試管，保持實(shí)驗(yàn)臺(tái)面和實(shí)驗(yàn)柜內(nèi)的整潔。⑾ 嚴(yán)禁抄拿他組儀器，不得將器皿遺棄在分光光度計(jì)內(nèi)和其他實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上，打破了玻璃儀器要及時(shí)向教師報(bào)告，并自覺登記，學(xué)期結(jié)束時(shí)按規(guī)定進(jìn)行處理。⒀ 每日實(shí)驗(yàn)完畢，值日生要認(rèn)真做好實(shí)驗(yàn)室的衛(wèi)生值日工作。最后離開實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)人員，必須檢查并關(guān)好水、電、門、窗。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,蛋白質(zhì)部分性質(zhì)實(shí)驗(yàn)

8、 —蛋白質(zhì)顏色反應(yīng)和沉淀反應(yīng),中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,蛋白質(zhì)分子中某種或某些集團(tuán)可與顯色劑作用，產(chǎn)生顏色。不同的蛋白質(zhì)由于所含的氨基酸不完全相同，顏色反應(yīng)亦不完全相同。顏色反應(yīng)不是蛋白質(zhì)的專一反應(yīng)，一些非蛋白物質(zhì)也可產(chǎn)生同樣的顏色反應(yīng)，因此不能根據(jù)顏色反應(yīng)的結(jié)果來(lái)決定被測(cè)物是否為蛋白質(zhì)。另外，顏色反應(yīng)也可作為一些常用蛋白質(zhì)定量測(cè)定的依據(jù)。,第一部分 蛋白

9、質(zhì)的顏色反應(yīng),中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,一、試驗(yàn)原理,二、實(shí)驗(yàn)儀器1、吸管 2、滴管 3、試管 4、電爐 5、pH試紙 6、水浴鍋三、實(shí)驗(yàn)試劑1、卵清蛋白液：雞蛋清用蒸餾水稀釋10-20倍，3-4層紗布過濾，濾液放在冰箱里冷藏備用。2、 0.5%苯酚：1g苯酚加蒸餾水稀釋至200ml。3、Millon’s試劑：40g汞溶于60ml濃硝酸（水浴加溫助溶）溶解后，冷卻，加二倍體積的蒸餾水，混

10、勻，取上清夜備用。此試劑可長(zhǎng)期保存。4、1%CuSO4：1g CuSO4晶體溶于蒸餾水，稀釋至100ml5、10%NaOH：10g NaOH溶于蒸餾水，稀釋至100ml6、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀釋至100ml.7、尿素晶體 8、濃硝酸 9、冰醋酸 10、濃硫酸,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,（一）米倫（Millon’s）反應(yīng)原理：米倫試劑是硝

11、酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝酸汞的混合物。他能與苯酚及某些二羥基苯衍生物起顏色反應(yīng)。組成蛋白質(zhì)的氨基酸中只有酪氨酸含苯酚基團(tuán)，因此該反應(yīng)為蛋白質(zhì)中酪氨酸存在的依據(jù)。操作：1、苯酚實(shí)驗(yàn)：取0.5%苯酚溶液1ml于試管中，加Millon’s試劑0.5ml，于電爐上小心加熱，溶液即出現(xiàn)玫瑰紅色。2、蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)：取2ml蛋白液，加Millon’s試劑0.5ml，出現(xiàn)白色的蛋白質(zhì)沉淀，小心加熱，凝固的蛋白質(zhì)出現(xiàn)紅色。,中國(guó)海洋大

12、學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,四、實(shí)驗(yàn)步驟,（二）雙縮脲反應(yīng)原理：尿素被加熱，則兩分子的尿素放出一分子氨而形成雙縮脲。雙縮脲在堿性環(huán)境中，能與硫酸銅結(jié)合成紫色的化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵與縮脲結(jié)構(gòu)相似，故也能進(jìn)行此反應(yīng)。雙縮脲反應(yīng)可作為蛋白質(zhì)定量測(cè)定的依據(jù)。 操作：1、尿素實(shí)驗(yàn)取少量尿素晶體放在干燥的試管中，微火加熱使其熔化成液體，此時(shí)有氨氣放出，可用濕潤(rùn)的試紙檢驗(yàn)，至液體重新

13、結(jié)晶出現(xiàn)白色固體時(shí)，停止加熱，冷卻。然后加10%NaOH溶液1ml，搖勻，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混勻，觀察有無(wú)紫色出現(xiàn)。2、蛋白液實(shí)驗(yàn)取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，搖勻，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混勻，觀察有無(wú)紫色出現(xiàn)。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,（三）黃色反應(yīng)原理：蛋白質(zhì)分子中含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），于濃硝酸可反應(yīng)并生成黃色物質(zhì)，此物質(zhì)

14、在堿性環(huán)境下變?yōu)榻埸S色的硝基苯衍生物硝醌酸等。操作：取一支試管，加入1ml蛋白液及濃硝酸5滴。加熱，冷卻后注意顏色變化。然后再加入10%NaOH溶液1ml，顏色有什么變化？,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,（四）茚三酮反應(yīng)原理：蛋白質(zhì)與茚三酮共熱，產(chǎn)生蘭紫色的還原茚三酮、茚三酮和氨的縮合物。此反應(yīng)為一切蛋白質(zhì)及a-氨基酸所共有。亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）與茚三酮反應(yīng)呈黃色，含有氨基的其他物質(zhì)亦呈此

15、反應(yīng)。操作：取蛋白液1ml于試管中，加4-8滴茚三酮溶液，加熱至沸，即有藍(lán)紫色出現(xiàn)。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,第二部分 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng),一、試驗(yàn)原理蛋白質(zhì)是親水性膠體，在溶液中的穩(wěn)定性與質(zhì)點(diǎn)大小、電荷、水化作用有關(guān)，但其穩(wěn)定性是有條件的，相對(duì)的。如果條件發(fā)生了變化，破壞了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)就會(huì)從溶液中沉淀出來(lái)。,蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：水化膜、帶電荷。當(dāng)破壞這兩個(gè)因素時(shí)，蛋白質(zhì)中從溶液中

16、析出而產(chǎn)生沉淀。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,二、實(shí)驗(yàn)儀器1、移液管 2、吸管 3、試管 4、電爐三、實(shí)驗(yàn)試劑1、卵清蛋白液：雞蛋清用蒸餾水稀釋10-20倍，3-4層紗布過濾，濾液放在冰箱里冷藏備用。2、飽和硫酸銨溶液：100ml蒸餾水中加硫酸銨至飽和。3、硫酸銨晶體：用研缽研成碎末。4、95%乙醇。5、醋酸鉛溶液：1g醋酸鉛溶于蒸餾水并稀釋至100ml6、硫酸銅溶液：1g CuSO4晶

17、體溶于蒸餾水，稀釋至100ml7、氯化鈉晶體8、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸餾水中并稀釋至100ml9、飽和苦味酸溶液：100ml蒸餾水中加苦味酸至飽和。10、1%醋酸溶液。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）蛋白質(zhì)的鹽析作用原理：向蛋白質(zhì)中加入大量的中性鹽（硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等），使蛋白質(zhì)膠體顆粒脫水，破壞其水化層，同時(shí)它所帶有的電荷亦被中性鹽上所帶的相反電荷的離子所

18、中和。于是穩(wěn)定因素被破壞，蛋白質(zhì)聚集沉淀。鹽析作用一般不使蛋白質(zhì)變性。操作：1、取試管1支，加蛋白液2ml，然后加固體硫酸銨(加的過程要緩慢，加的量要少隨時(shí)搖勻），直至其飽和（大約為50%）。搖勻靜置數(shù)分鐘，則有球蛋白析出。 2、將上述混合液過濾。向?yàn)V液中逐漸加入少量固體硫酸銨（每次加入量約為米粒大小），邊加邊搖，直至飽和為止，此時(shí)析出為清蛋白。再加入少量蒸餾水，觀察沉淀是否溶解。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分

19、子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,（二）有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)原理：某些有機(jī)溶劑（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白質(zhì)脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用，致使蛋白質(zhì)顆粒容易凝聚而沉淀。操作：取一試管加蛋白液1ml，，加入晶體氯化鈉少許，待溶解后再加95%乙醇3ml,搖勻，觀察現(xiàn)象。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,（三）重金屬鹽與某些有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)原理：重金屬離子（如Pb2+、Cu2+等）與蛋白質(zhì)的羧基等結(jié)

20、合生成不溶性的金屬鹽類而沉淀，同時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生變性。某些有機(jī)酸的酸根則與蛋白質(zhì)的自由氨基結(jié)合而沉淀。 操作：1、取試管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸鉛溶液，另一支管中滴加1%硫酸銅溶液，至有沉淀產(chǎn)生。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,（四）生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)原理：植物體內(nèi)具有顯著生理作用的含氮堿性化合物成為生物堿。能沉淀生物堿或與其產(chǎn)生顏色反應(yīng)的物質(zhì)稱為生物堿試劑，如鞣酸等。當(dāng)溶液PH小于等

21、電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷，容易與生物堿試劑的負(fù)離子發(fā)生反應(yīng)而沉淀。操作：取2支試管，分別加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加飽和苦味酸和鞣酸數(shù)滴，觀察現(xiàn)象。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,（一）   米倫（Millon’s）反應(yīng)1、苯酚實(shí)驗(yàn)：取0.5%苯酚溶液1ml于試管中，加Millon’s試劑0.5ml，電爐小心加熱觀察顏色變化。2、蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)：取2ml蛋白液，加Millon’s

22、試劑0.5ml，出現(xiàn)白色的蛋白質(zhì)沉淀，小心加熱，觀察現(xiàn)象。（二）   雙縮脲反應(yīng)1、取少量尿素晶體放在干燥的試管中，微火加熱熔化，至重新結(jié)晶時(shí)冷卻。然后加10%NaOH溶液1ml，搖勻，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混勻，觀察現(xiàn)象。 2、取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，搖勻，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混勻，觀察現(xiàn)象。（三）   黃色反應(yīng) 取一支試管，加入1m

23、l蛋白液及濃硝酸5滴。加熱，冷卻后注意顏色變化。然后再加入10%NaOH溶液1ml，顏色有什么變化？（四）   茚三酮反應(yīng) 取蛋白液1ml于試管中，加10滴茚三酮溶液，加熱至沸，即有藍(lán)紫色出現(xiàn)。,,（一）蛋白質(zhì)的鹽析作用1、取試管1支，加蛋白液2ml，然后加固體硫酸銨(加的過程要緩慢，加的量要少，隨時(shí)搖勻），直至其飽和（大約為50%）。搖勻靜置數(shù)分鐘，則有球蛋白析出。 2、將上述混合液過濾。向?yàn)V液中逐漸加

24、入少量固體硫酸銨，直至飽和為止，此時(shí)析出為清蛋白。再加入少量蒸餾水，觀察沉淀是否溶解。（二）有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)試管中加蛋白液1ml，加晶體氯化鈉少許，溶解后加95%乙醇3ml,搖勻，觀察現(xiàn)象。（三）重金屬鹽與某些有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)1、取試管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸鉛溶液，另一支管中滴加1%硫酸銅溶液，至有沉淀產(chǎn)生。2、取一支試管加蛋白液2ml，再加入10%三氯乙酸1ml，充分混勻，觀察結(jié)果。（四）生物堿試劑

25、沉淀蛋白質(zhì)取一支試管，加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加飽和苦味酸數(shù)滴，觀察現(xiàn)象。,蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng),蛋白質(zhì)的沉淀,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,http://222.195.234.199/openclass登錄名：自己的學(xué)號(hào)密碼：自己的學(xué)號(hào)大家先把電子版的實(shí)驗(yàn)報(bào)告作好，然后在周五或周六以后再上傳文件實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求：1目的2原理3實(shí)驗(yàn)儀器4實(shí)驗(yàn)試劑5實(shí)驗(yàn)步驟6實(shí)驗(yàn)結(jié)果7實(shí)驗(yàn)分析下次實(shí)驗(yàn)：血糖的定

26、量測(cè)定-folin-wu法,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,,Folin-Wu法定量測(cè)定血糖的含量,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,,,1.氧化供能 2.人體的主要組成成分之一 糖蛋白、糖脂、蛋白多糖、核糖；轉(zhuǎn)化成脂肪和某些非必需氨基酸等3.糖代謝紊亂→供能障礙→一系列代謝變化,,糖的重要生理功能：,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,血糖及血糖水平的概念：

27、,血糖：指血液中的單糖：葡萄糖,血糖水平：血漿中葡萄糖濃度,血糖總維持在恒定水平：3.9∽6.7mmol/L,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,,,血糖的來(lái)源和去路,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,血糖測(cè)定的目的和意義,臨床：血糖檢測(cè)是目前診斷糖代謝異常相關(guān)疾病的主要依據(jù)。科研：在代謝疾病的研究中，常測(cè)定血糖。在某些藥物的研究中，也涉及血糖的測(cè)定。,調(diào)節(jié)血糖水平的激素：胰島素、胰高血糖素、

28、糖皮質(zhì)激素和腎上腺素。血糖水平異常：⑴高血糖及糖尿病；⑵低血糖,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,,高血糖癥：指空腹血糖濃度超過7.3mmol/L,有生理性和病理性之分，臨床上最常見的病理性高血糖癥是糖尿病?！√悄虿。菏且环N慢性、復(fù)雜的代謝紊亂性疾病,系胰島素絕對(duì)不足或相對(duì)不足，以高血糖癥為基本生化特點(diǎn)。同時(shí)伴有糖、脂類、蛋白質(zhì)、水、電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂，甚至出現(xiàn)一系列并發(fā)癥如眼、腎的微血管病變及神經(jīng)病變等。,

29、,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,,癥狀＋隨機(jī)血漿葡萄糖≥ 11.1mmol/L,或空腹血漿葡萄糖≥ 7.0mmol/L。癥狀不典型者需另一天再次證實(shí)。隨機(jī)血糖是指一天中的任一時(shí)間采血測(cè)得的血糖濃度。糖尿病典型的癥狀是“三多一少”，即多飲、多尿、多食及消瘦,,糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn),中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,,,血糖的測(cè)定方法,測(cè)定方法,酶法：（1）己糖激酶法（HK）　　?。?）

30、葡萄糖氧化酶法（GOD法）特異性高，靈敏度高，干擾因素少，適用于自動(dòng)化分析，為葡萄糖測(cè)定的參考方法，但是試劑較貴,,無(wú)機(jī)化學(xué)法： Folin-Wu法，特異性差,有機(jī)化學(xué)法：鄰甲苯胺法、聯(lián)苯胺法、氨基聯(lián)苯法　　　　　　干擾因素多,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,掌握Folin－Wu法測(cè)定血糖含量的原理和方法。學(xué)會(huì)制備無(wú)蛋白血濾液。掌握7200型可見分光光度計(jì)的使用方法。,一、目的要求,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)

31、實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,二、實(shí)驗(yàn)原理,葡萄糖是一種多羥基的醛類化合物。其醛基具有還原性，與堿性銅試劑混合加熱，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧基，Cu2+即被葡萄糖還原成Cu+（Cu2O）而沉淀。 Cu2+( CuSO4 )+葡萄糖 Cu+ （Cu2O）無(wú)蛋白血濾液中的葡萄糖和酸性鉬酸鹽溶液共熱反應(yīng), Cu2O又把酸性鉬酸試劑（Mo6+）還原成低價(jià)的藍(lán)色鉬化合物—鉬藍(lán) 。Cu2O+酸性鉬酸試劑 藍(lán)色鉬

32、化合物 OD420比色 血濾液中葡萄糖的含量與產(chǎn)生的Cu2O成正比，而Cu2O的量與產(chǎn)生的鉬化合物的量成正比?？捎帽壬ǘ康臏y(cè)定。,,,,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,三、實(shí)驗(yàn)儀器,1、25mL血糖管×3支；2、血糖管橡膠塞×3個(gè)；3、沸水浴小鍋×1個(gè)； 4、100mL錐形瓶×2個(gè)；5、電爐×1個(gè)；6、濾紙×1

33、盒；7、吸耳球×2個(gè)； 8、7200型分光光度計(jì)×1臺(tái);,血糖管,7200型分光光度計(jì),中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,1、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（0.1mg/ml）(1)1%葡萄糖母液：稱取1.000g葡萄糖，溶于蒸餾水，稀釋并定容至100ml。(2)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中，加蒸餾水定容。2、10%鎢酸鈉溶液：稱取鎢酸鈉10g，溶于

34、蒸餾水并定容至100毫升。3、0.33mol/LH2SO4溶液：于53ml蒸餾水中加入1ml的濃硫酸。4、堿性硫酸銅溶液 A液：無(wú)水碳酸鈉35g，酒石酸鈉13g及碳酸氫鈉11g溶于蒸餾水，稀釋定容至1000ml. B液：硫酸銅晶體5g，溶于蒸餾水并定容至100ml。 臨用時(shí)，A液：B液=9：1混合（體積比），混合液于冰箱中保存（4℃）。,四、實(shí)驗(yàn)試劑,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,5、酸性鉬酸鹽

35、溶液：稱取鉬酸鈉600g,用少量蒸餾水溶解后傾入2000ml 的容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，傾入另一較大的試劑瓶中，加溴水0.5ml，搖勻，靜止數(shù)小時(shí)后取上清夜500ml，于1000ml容量瓶中，徐徐加入225ml85%磷酸，邊加邊搖勻，再加25%硫酸150ml。置暗處次日，用空氣將剩余的溴趕去。然后加99%醋酸75ml，搖勻，用蒸餾水稀釋定容至1000ml,貯于棕色瓶中。,四、實(shí)驗(yàn)試劑,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分

36、子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,1、無(wú)蛋白血濾液的制備：用5ml移液管吸取全血（已加抗凝劑）1ml,緩緩放入100ml錐形瓶中，加蒸餾水7ml，搖勻，溶血后（血液變?yōu)榧t色透明）加10%鎢酸鈉1ml，搖勻.。再加0.33mol/L H2SO41ml，邊加邊搖，加畢充分搖勻，放置5～15分鐘，至沉淀變?yōu)榘底厣ㄈ绮蛔兩稍偌?.33mol/L H2SO41-2滴）。用干濾紙過濾。先傾入少許，待濾紙濕潤(rùn)后在全部倒入，如濾液不清需重新過濾。每毫升無(wú)蛋白血

37、濾液相當(dāng)于1/10ml全血。,五、實(shí)驗(yàn)步驟,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,2、血糖的定量測(cè)定：取25ml的血糖管3支，編號(hào)。第一支血糖管中加入2ml蒸餾水（空白管）；第二支血糖管中加2ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液；用吸管吸取無(wú)蛋白血濾液2ml，放入第三支血糖管中。然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的堿性硫酸銅溶液，同時(shí)置于沸水浴中8分鐘，取出，在流水中迅速冷卻后,勿搖動(dòng)，各加4ml酸性鉬酸鹽溶液。一分鐘后，用蒸餾水

38、稀釋至25ml，混勻，用7200分光光度計(jì)在420nm波長(zhǎng)處比色，以空白管調(diào)節(jié)零點(diǎn)。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,按下式計(jì)算100ml全血中所含血糖的含量m=A1/A0×C0÷0.1×100式中: m=100ml全血中含血糖毫克數(shù) ; C0=標(biāo)準(zhǔn)液葡萄糖含量（0.1mg/ml）；A1=樣品液光吸收值 ; A0=標(biāo)準(zhǔn)液光吸收值 0.1：1ml無(wú)蛋白血溶液相對(duì)于0.1ml全血

39、,六、結(jié)果計(jì)算：,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,,注意事項(xiàng)：1.加硫酸、鎢酸鈉時(shí)，要邊加邊搖勻2.沉淀由鮮紅變?yōu)榘底厣?，是因鎢酸鈉與硫酸生成鎢酸，在適當(dāng)酸度時(shí)，使血紅蛋白變性沉淀，如果沉淀不變暗棕色或重新過濾后仍混濁，是因?yàn)檠褐兴涌鼓齽┻^多，可以加入10％硫酸1-2滴，待暗棕色后再過濾。3.用定量濾紙過濾后應(yīng)該得到完全澄清無(wú)色之無(wú)蛋白血濾液?！∪绻玫饺詭в屑t色的血濾液則說(shuō)明蛋白質(zhì)未被完全去除。,中國(guó)

40、海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,【思考題】,1、實(shí)驗(yàn)過程中那些操作可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性？2、實(shí)驗(yàn)中，血糖管有什么作用？3、實(shí)驗(yàn)過程中，為什么要用流水冷卻加入堿性硫酸銅液反應(yīng)后的血糖管？,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,五、實(shí)驗(yàn)步驟,1、無(wú)蛋白血濾液的制備：,,蒸餾水7ml,搖勻,10%鎢酸鈉1ml,,搖勻,0.33mol/L H2SO41ml,,邊加邊搖,加畢充分搖勻,放置5—15分(

41、沉淀變?yōu)榘底厣?(如不變色,再加0.33mol/L H2SO41~2滴 ),干濾紙過濾,無(wú)蛋白血濾液(每毫升相當(dāng)于1/10ml全血),20ml錐形瓶,溶血(變?yōu)榧t色透明),,用5ml移液管取全血1ml（已加抗凝劑,,,2、血糖的定量測(cè)定：,,,m=OD1/OD2× C× 10× 100,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,分光光度計(jì)的工作原理,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分

42、子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,朗伯-比爾定律,朗伯定律：A=k1L 比爾定律：A=k2C朗伯-比爾定律：如同時(shí)考慮液層厚度和溶液濃度對(duì)吸光度的影響，則吸光度與溶質(zhì)的濃度和溶液的厚度的乘積成正比。 A=KLC,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,朗伯-比爾定律應(yīng)用,A標(biāo)=KC標(biāo)LA樣=KC樣L,,標(biāo)準(zhǔn)品法測(cè)定未知樣品含量,,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,72

43、00型分光光度計(jì)的操作程序,連接儀器電源線，確定儀器供電電源有良好的接地性能。接通電源，使儀器預(yù)熱20分鐘。用鍵設(shè)置測(cè)試方式：投射比（T），吸光度（A），已知標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度值方式（C）和已知標(biāo)準(zhǔn)樣品斜率（F）方式。用波長(zhǎng)選擇旋鈕設(shè)置您所需的分析波長(zhǎng)。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,將參比樣品溶液和被測(cè)樣品溶液分別倒入比色皿中，打開樣品室蓋，將盛有溶液的比色皿分別插入比色皿槽中，蓋上樣品室蓋。一般情況下，參比

44、樣品放在第二個(gè)槽位中。將0％T校具（黑體）置入光路中，在T方式下按“0％T”鍵，此時(shí)顯示器顯示“000.0”,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,按 MODE鍵選擇A模式將參比樣品拉入光路中，按“0A/100％T”鍵調(diào)0A/100％T，此時(shí)顯示器顯示的“BLA”直至顯示“0.000”A為止。當(dāng)儀器顯示器顯示出“0.000”A后，將被測(cè)樣品推入光路，這時(shí)，您便可從顯示器上得到被測(cè)樣品的吸光度。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基

45、礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,,,,分光光度計(jì)的使用注意事項(xiàng):,比色皿的清潔程度，直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，特別要將比色皿清洗干凈。裝樣前處理：自來(lái)水反復(fù)沖洗→蒸餾水漂洗2次→待裝溶液漂洗2次。用完后用自來(lái)水和蒸餾水洗凈并用檫鏡紙檫干放回比色皿盒中。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,,,,拿

46、放比色皿時(shí)，應(yīng)持其“毛面”，不要接觸“光面”。,,若比色皿外表面有液體，應(yīng)用擦鏡紙朝同一方向拭干，以保證吸光度測(cè)量不受影響。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,,,,比色皿內(nèi)盛液應(yīng)為其容量的2/3，過少會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，過多易在測(cè)量過程中外溢，污染儀器。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,,福林(Folin)-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,蛋

47、白質(zhì)的定量分析是生物化學(xué)和其它生命學(xué)科最常涉及的分析內(nèi)容，是臨床上診斷疾病及檢查康復(fù)情況的重要指標(biāo)，也是許多生物制品，藥物、食品質(zhì)量檢測(cè)的重要指標(biāo)。在生化實(shí)驗(yàn)中，對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的定量分析，則是經(jīng)常進(jìn)行的一項(xiàng)非常重要的工作。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,蛋白質(zhì)是一種十分重要的生物大分子：它的種類很多，結(jié)構(gòu)不均一，分子量又相差很大，功能各異，這樣就給建立一個(gè)理想而又通用的蛋白質(zhì)定量分析的方法代來(lái)了

48、許多具體的困難。目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種，下面列出根據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測(cè)定方法：物理性質(zhì)：紫外分光光度法化學(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry 法， BCA法，膠體金法染色性質(zhì)：考馬氏亮藍(lán)染色法、銀染法其他性質(zhì)：熒光法,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,蛋白質(zhì)不同方法比較,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,一、實(shí)驗(yàn)原理,蛋白質(zhì)或多肽分子中有帶酚基

49、酪氨酸或色氨酸，在堿性條件下，可使酚試劑中的磷鉬酸化合物還原成藍(lán)色（生成鉬藍(lán)和鎢藍(lán)化合物）。藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，可用比色法測(cè)定。此法的特點(diǎn)是靈敏度高，較雙縮脲高兩個(gè)數(shù)量級(jí)，較紫外法略高，操作稍微麻煩，反應(yīng)約在15分鐘有最大顯色，并最少可穩(wěn)定幾個(gè)小時(shí)，其不足之處是干擾因素較多，有較多種類的物質(zhì)都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,二、實(shí)驗(yàn)儀器1.卵清蛋白片

50、2.7200分光光度計(jì)3.試管 4.移液管三、實(shí)驗(yàn)試劑1.Folin-酚試劑A：堿性銅溶液 甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氫氧化鈉溶液中 乙液：取CuSO4.5H2O晶體0.5g，溶于1%酒石酸鉀100ml中。臨用時(shí)按甲：乙=50：1混合使用。2.Folin-酚試劑B：將100g鎢酸鈉、25g鉬酸鈉、700ml蒸餾水、50ml85%磷酸繼10

51、0ml濃鹽酸置于1500ml的磨口圓底燒瓶中，充分混勻后，接上磨口冷凝管，回餾10小時(shí)，再加入硫酸鋰150g，蒸餾水50ml及液溴數(shù)滴，開口煮沸15分鐘，在通風(fēng)櫥內(nèi)驅(qū)除過量的溴。冷卻，稀釋至1000ml，過濾，濾液成微綠色，貯于棕色瓶中。臨用時(shí)，用1mol/l的氫氧化鈉溶液滴定，用酚酞作指示劑，根據(jù)滴定結(jié)果，將試劑稀釋至相當(dāng)于1mol/L的酸。3.1mg/mL牛血清蛋白液：稱取1g牛血清蛋白片溶于0.9%氯化鈉溶液中，并稀釋至 10

52、00ml,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,四、實(shí)驗(yàn)步驟,1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取7支干燥的試管，編號(hào)，按下表加入試劑，比色后，以光密度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)作圖。2.樣品測(cè)定 準(zhǔn)確吸取樣液0.5ml于干燥的試管中，同樣按下表加入試劑，測(cè)出光密度值后，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣液的蛋白質(zhì)濃度。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生

53、物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,【注意事項(xiàng)】,1、Tris緩沖液、蔗糖、硫酸胺、基化物、酚類、檸檬酸以及高濃度的尿素、胍、硫酸鈉、三氯乙酸、乙醇、丙酮……等均會(huì)干擾Folin-酚反應(yīng)。2、當(dāng)酚試劑加入后，應(yīng)迅速搖勻（加—管搖一管）以免出現(xiàn)渾濁。3、由于這種呈色化合物組成尚未確立，它在可見光紅外光區(qū)呈現(xiàn)較寬吸收峰區(qū)。不同實(shí)驗(yàn)室選用不同波長(zhǎng)，有選用500或 540nm，有選用640nm，700或750nm。選用較高波長(zhǎng)，樣品呈現(xiàn)較大的光吸收，本實(shí)驗(yàn)選用波長(zhǎng)

54、640nm。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,【思考題】,蛋白質(zhì)含量測(cè)定的方法有哪些，各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？哪些因素可干擾福林(Folin)-酚試劑法測(cè)定蛋白？結(jié)合實(shí)驗(yàn)經(jīng)歷，談?wù)効梢詮哪男┓矫媸箤?shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確？,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,附：標(biāo)準(zhǔn)曲線EXCEL表制作：,1、將濃度和所測(cè)OD值輸入到EXCEL表中。2、將數(shù)據(jù)區(qū)域全部選中。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物

55、學(xué)實(shí)驗(yàn)室,3、點(diǎn)擊“圖表向?qū)А辨I。,4、在圖標(biāo)類型中選擇“XY散點(diǎn)圖”，然后點(diǎn)擊第一個(gè)圖。,,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,5.點(diǎn)擊“下一步”。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,6、在“圖表選項(xiàng)”的“標(biāo)題”中，于選中的紅色區(qū)域內(nèi)可以填入相應(yīng)的名稱。然后點(diǎn)擊“完成”。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,7、鼠標(biāo)點(diǎn)住數(shù)值點(diǎn)，右鍵單擊，選擇”添加趨勢(shì)線”,中國(guó)海洋大學(xué)生物

56、基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,8、在“添加趨勢(shì)線”對(duì)話框中選擇“線性”分析類型，然后點(diǎn)“確定”。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,,9、點(diǎn)住直線右鍵單擊，點(diǎn)“趨勢(shì)線格式”，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行編輯。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,10、在“選項(xiàng)”中勾選“顯示公式”和“顯示R平方值”兩項(xiàng)，點(diǎn)“確定”,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,,11、曲線上會(huì)顯示出此標(biāo)準(zhǔn)曲

57、線的回歸方程和R2，將樣品測(cè)得的OD值（即Y值）代入方程，就得出樣品的濃度（即X值）。 這里的R2表示標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性，即R2越接近于1，你所測(cè)的數(shù)值越準(zhǔn)確，也越具有說(shuō)服力。一般要求至少R2=0.99以上為好。,,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,氨基酸的紙層析,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,層析技術(shù)介紹,一、定義層析技術(shù)(chromatography）也稱色譜技術(shù)，是一種利用

58、混合物中諸組分在兩相間的分配原理以獲得分離的方法。具體的說(shuō)是根據(jù)被分離的混合物中各組分的理化性質(zhì)（分子的形狀和大小、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等）的不同，使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動(dòng)相）中進(jìn)行分配以獲得分離的方法。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,固定相：固定相是層析的一個(gè)基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅

59、膠或纖維素上的溶液）。流動(dòng)相：在層析過程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)移動(dòng)的液體、氣體等，都稱為流動(dòng)相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時(shí)稱為展層劑。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,二、層析技術(shù)的原理,層析法是利用不同物質(zhì)理化性質(zhì)的差異而建立起來(lái)的技術(shù)。所有的層析系統(tǒng)都由兩個(gè)相組成：一是固定相，另一是流動(dòng)相。當(dāng)待分離的混合物隨流動(dòng)相通過固定相時(shí)，由于各組分的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶

60、解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量比）不同，且隨流動(dòng)相向前移動(dòng)，各組分不斷地在兩相中進(jìn)行再分配。分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組分，從而達(dá)到將各組分分離的目的。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,三、發(fā)展簡(jiǎn)史,層析分離技術(shù)在20世紀(jì)初就已得到應(yīng)用：1903年用于植物色素的分離,各種色素以不同的速率流動(dòng)后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”1931年用氧化鋁柱分離了胡蘿卜素的兩種同分異

61、構(gòu)體；1944年出現(xiàn)了以濾紙作為支持物的紙層析；20世紀(jì)六十年代末出現(xiàn)了高效液相色譜(HPLC)。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,四、層析技術(shù)的種類,◆按層析的機(jī)理劃分：　　吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。　吸附層析：利用吸附劑表面對(duì)不同組分吸附性能的差異，達(dá)到分離鑒定的目的?！》峙鋵游觯豪貌煌M分在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使之分離?！‰x子交換層析：利

62、用不同組分對(duì)離子交換劑親和力的不同?！∧z層析：利用某些凝膠對(duì)于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,◆按流動(dòng)相與固定相的不同劃分：　　氣相層析、液相層析。這兩大類層析是以流動(dòng)相不同來(lái)劃分的。如同時(shí)區(qū)分流動(dòng)相和固定相，劃分為：氣固層析、氣液層析、液固層析和液液層析等。◆按操作形式劃分：　　柱層析、紙層析、薄層層析、高效液相層析等?！〖垖游觯河脼V紙做液體的載體，點(diǎn)樣后

63、，用流動(dòng)相展開，以達(dá)到分離鑒定的目的?！”訉游觯簩⑦m當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、通過氨基酸的分離，學(xué)習(xí)并掌握紙層析的原理和操作技術(shù)； 2、掌握分配層析法； 3、掌握影響分配系數(shù)的因素。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,二、實(shí)驗(yàn)原理,紙層析法：是以濾紙作為惰性支持物的分配層析。 濾紙纖

64、維上羥基具有親水性，因此吸附水作為固定相，通常把有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相。 將樣品點(diǎn)在濾紙上，進(jìn)行展層，樣品中的各種氨基酸在兩相溶劑中不斷進(jìn)行分配。由于它們的分配系數(shù)不同，不同氨基酸隨流動(dòng)相移動(dòng)的速率就不同，于是就將這些氨基酸分離開來(lái)，形成距原點(diǎn)不等的層析點(diǎn)。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,分配層析法：利用物質(zhì)在兩種或兩種以上不同的混合溶劑中的分配系數(shù)不同，而達(dá)到分離目的的一種實(shí)驗(yàn)方法。在一定條件下，

65、一種物質(zhì)在某種溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)α是一個(gè)常數(shù)。,溶質(zhì)在固定相的濃度(Cs)分配系數(shù)α= 溶質(zhì)在流動(dòng)相的濃度（Cl),,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,溶劑系統(tǒng)：正丁醇：甲酸：水=15：3：2 固定相：水和濾紙纖維素有較強(qiáng)的親和力，因而其擴(kuò)散作用降低形成固定相; 流動(dòng)相：有機(jī)溶劑和濾紙親和力弱，所以在濾紙毛細(xì)管中自由流動(dòng)，形成流動(dòng)相。 由于混合液中各種氨基酸的α值不同，所以

66、移動(dòng)速率（即遷移率Rf值）就不同，從而達(dá)到分離的目的。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,移動(dòng)速率(比移值)： 原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離 Rf = 原點(diǎn)到溶劑前沿的距離,,,,,,,,,,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,影響Rf值的主要因素： Rf決定于被分離物質(zhì)在兩

67、相間的分配系數(shù)以及兩相間的體積比。由于在同一實(shí)驗(yàn)條件下，兩相體積比是一常數(shù)，所以主要決定于分配系數(shù)。不同物質(zhì)分配系數(shù)不同，Rf也就不同。（1）物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和分子極性： 物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同極性不同，在兩相中的溶解度也就不同，物質(zhì)的極性決定了物質(zhì)在水和有機(jī)溶劑之間的分配系數(shù)，極性大的易溶于水中即固定相中，Rf小；反之,Rf則較大。,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,（2）層析溶劑： 首先，溶劑的純度要高

68、。 其次，溶劑系統(tǒng)選擇應(yīng)考慮被分離的物質(zhì)在溶劑系統(tǒng)中的Rf在0.05～0.85。 再次，溶劑系統(tǒng)必須新鮮配制，如正丁醇- 甲酸-水系統(tǒng)久放易引起酯化。 （3）pH值： 溶劑、濾紙和樣品的pH值都會(huì)影響物質(zhì)的解離，從而影響物質(zhì)的極性和溶解度，使Rf改變；,中國(guó)海洋大學(xué)生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,（4）濾紙： 層析濾紙由高純度棉花制成，要求濾紙要清潔，質(zhì)地均一，厚薄一致，