羅非魚源無乳鏈球菌特異性卵黃抗體的制備及其活性研究.pdf

1、全球水產(chǎn)業(yè)每年因無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae/group B Streptococcus，GBS)病的流行性暴發(fā)造成了慘重的經(jīng)濟損失，羅非魚是GBS的易感宿主之一，而近年來引起我國養(yǎng)殖羅非魚暴發(fā)該疾病的GBS又以Ⅰa型為主。人們通常使用抗生素對羅非魚GBS病進行防治，隨著抗生素帶來的問題日益嚴重，人們開始研制或者找尋更有效、更安全的新型藥物來替代抗生素。在尋找抗生素替代品的過程中，卵黃抗體(immunog

2、lobulin of eggyolk，IgY)由于生物學上不激活補體，不與Fc受體和人類風濕因子結合，可與異源抗原上的更多表位發(fā)生反應等高特異性優(yōu)勢;以及制備上成本低、產(chǎn)出率高、提純簡便快捷，并具有耐酸堿、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，引起了許多研究人員的興趣。
　　本研究以Ⅰa型菌株GBS/HN0303為抗原免疫蛋雞，采集免疫蛋;采用氯仿法與飽和硫酸銨鹽析法結合的方式制備特異性IgY。運用玻片凝集試驗、免疫印跡(WB)、細菌特異性染色、酶聯(lián)免

3、疫吸附試驗(ELISA)與試管凝集試驗等方法，從定性到定量，對所得IgY抗體特性、在蛋雞體內(nèi)免疫應答情況及其理化性質(zhì)進行檢測;并通過體外抑菌與體內(nèi)抗病試驗對其抗菌效果進行評價。
　　1.IgY制備效果及理化性質(zhì)
　　本研究以1×109CFU/mL菌液制成的全菌滅活疫苗，可引起蛋雞較好的免疫應答，經(jīng)過四次免疫后，雞蛋中的IgY可以達到較高的濃度;經(jīng)間接ELISA測定，雞蛋中IgY抗體水平峰值出現(xiàn)于四免后第48d，可以達到1∶1

4、00000，并可維持至少一個月時間。通過玻片凝集、特異性染色及免疫印跡等試驗，證明sp-IgY具有較高結合活性;另外在低溫環(huán)境下儲存IgY活性穩(wěn)定，且在pH3～7范圍內(nèi)，IgY抗體活性良好。
　　2.IgY的體外抑菌能力
　　在液體環(huán)境中，sp-IgY的抑菌效率明顯，28C下孵育，500μg/mL的sp-IgY可成功抑制等體積1×105CFU/mL的GBS/HN0303生長達12h;在固體培養(yǎng)條件下，sp-IgY抑菌效果與其

5、特異性組分含量正相關，含量越高，抑菌效果越佳，呈現(xiàn)出明顯的量效關系;還證明了sp-IgY在魚體內(nèi)對GBS/HN0303具有中和能力。
　　3.IgY的體內(nèi)抗病能力
　　以羅非魚為模型動物，檢驗了所制備IgY的防治功效?？傮w上，都表現(xiàn)出了對羅非魚免疫增強的作用，具體體現(xiàn)為攻毒后延緩羅非魚發(fā)病進程，其中sp-IgY組較對照組有效降低了累計死亡率，表現(xiàn)出了其具有特異性抗病能力;而將sp-IgY拌料口服免疫時，隨著飼料中sp-IgY