Bacillus subtilisJ-4菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)發(fā)酵條件優(yōu)化及粗提物穩(wěn)定性研究.pdf

1、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)J-4菌株是從健康肉雞糞便中分離得到的益生菌株，具有防治畜禽腹瀉、促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)的作用。J-4菌株能產(chǎn)生抑制大腸桿菌等腹瀉病原菌的胞外抑菌物質(zhì)，該抑菌物質(zhì)具有開發(fā)成為飼料添加劑的潛力。本研究?jī)?yōu)化了J-4菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的發(fā)酵條件，對(duì)抑菌物質(zhì)進(jìn)行初步分離，獲得其粗提物，并對(duì)粗提物抑菌活性的穩(wěn)定性進(jìn)行了初步研究。
　　通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)J-4菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最

2、佳培養(yǎng)條件為發(fā)酵溫度37℃、裝液量100mL(250mL)、接種量5％及發(fā)酵周期36h;最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖1.00％、黃豆餅粉1.00％、MgSO40.15％和Na2HPO4-NaH2PO40.10％。優(yōu)化后，J-4菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對(duì)應(yīng)的抑菌面積比基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)的抑菌圈面積增大50.25％。
　　通過比較乙醇、丙酮沉淀，乙酸乙酯、乙醚和三氯甲烷萃取，硫酸銨鹽析等方法對(duì)J-4菌株發(fā)酵上清液抑菌物質(zhì)的提取效果，確定硫酸銨

3、鹽析法是初步分離該抑菌物質(zhì)的最佳方法。鹽析的最佳硫酸銨濃度為60％飽和度，并通過截留分子量為8-10KD的透析膜透析，薄膜濃縮和冷凍干燥制備了該抑菌物質(zhì)的粗提物。
　　以含粗提物1.0mg/mL的溶液為對(duì)象，研究了溫度、pH、蛋白酶、有機(jī)溶劑、陰陽(yáng)離子及表面活性劑等對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響。在60℃或100℃條件下保溫20min，粗提物水溶液的抑菌活性基本不變，在121℃下保溫5min只能保持約50％的抑菌活性;在pH2.0～pH7.

4、0范圍內(nèi)隨著pH的升高，粗提物表現(xiàn)出的抑菌活性越強(qiáng)，超過pH7.0抑菌活性也隨之降低;粗提物溶液被100mg/mL的胃蛋白酶處理30min后，仍保持85％以上的抑菌活性，且對(duì)胰蛋白酶穩(wěn)定;SDS能明顯降低粗提物的抑菌活性，達(dá)到35mg/mL以上時(shí)，抑菌活性完全喪失;隨EDTA濃度的增大，抑菌物質(zhì)的活性逐漸降低;吐溫80和β-巰基乙醇對(duì)粗提物抑菌活性沒有影響。乙醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、乙醚、三氯甲烷和苯等7種有機(jī)溶劑對(duì)粗提物的抑菌活性基

5、本沒有影響。陽(yáng)離子Ca2+和K+對(duì)粗提物的抑菌活性有促進(jìn)作用，Na+和Mg2+對(duì)抑菌物質(zhì)的抑菌活性基本無影響，Mn2+對(duì)抑菌物質(zhì)的抑菌活性有一定的抑制作用;陰離子Cl-對(duì)粗提物的抑菌活性基本沒有影響，SO42-、NO3-、HCO3-和H2PO4-對(duì)抑菌活性均有一定的抑制作用。
　　總之，在優(yōu)化發(fā)酵條件，提高了抑菌物質(zhì)發(fā)酵活性的基礎(chǔ)上，確定了獲得粗提物的方法，并對(duì)粗提物活性的影響因素進(jìn)行了研究。為該抑菌物質(zhì)的進(jìn)一步深入研究及利用該抑