大黃素抑制肝癌細(xì)胞侵襲及誘導(dǎo)其凋亡的效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是一種發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤，由于其癥狀隱匿，大多數(shù)患者確診時(shí)已失去根治性手術(shù)的機(jī)會(huì)，而經(jīng)肝動(dòng)脈導(dǎo)管介入治療及化療等治療方式的效果尚未令人滿意，因此，從中醫(yī)藥的寶庫(kù)里發(fā)掘具有有效抗肝癌的藥物是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。大黃素(Emodin)是從中藥大黃里提取的一種有效藥物，臨床研究發(fā)現(xiàn)大黃素具有抑制肺癌、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌等多種腫瘤的作用，其機(jī)制與通過(guò)多種信號(hào)

2、通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡有關(guān)，同時(shí)還能抗腫瘤血管的生成。因此，大黃素抗腫瘤效應(yīng)具有廣譜性、多靶點(diǎn)的特征。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大黃素具有抑制肝癌增殖及抗肝癌轉(zhuǎn)移的作用，但是，其作用的具體機(jī)制及兩者之間的關(guān)系尚缺乏實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本課題組長(zhǎng)期從事中醫(yī)藥抗肝癌的效應(yīng)及機(jī)制研究，具備較好的實(shí)驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)并積累了較豐富的經(jīng)驗(yàn)，在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)低劑量的大黃素具有抗肝癌轉(zhuǎn)移的效應(yīng)，而高劑量的大黃素則具有明顯的誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用，因此，本課題主要從不同

3、濃度的大黃素對(duì)肝癌增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移的影響及其作用的分子機(jī)制進(jìn)行深入探討，為大黃素在臨床抗肝癌的應(yīng)用提供一定的基礎(chǔ)支撐。
　　目的:1.體外觀察大黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞系MHCC-97H遷移、侵襲的影響及其作用的分子機(jī)制。2.體外觀察大黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721增殖、凋亡的影響及其作用的分子機(jī)制，并在裸鼠體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　方法:1.運(yùn)用MTT、CCK8方法探索不同劑量的大黃素對(duì)MHCC-97H及SMMC-7721肝癌細(xì)胞

4、系增殖的影響。2.運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定不同劑量的大黃素對(duì)MHCC-97H及SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響。3.從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果中篩選出合適的Emodin濃度，以具有高侵襲遷移特性的MHCC-97H肝癌細(xì)胞系為主要模型，應(yīng)用Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大黃素是否具有抑制MHCC-97H細(xì)胞遷移的效應(yīng);另外，應(yīng)用預(yù)制Matrige膠的Transwell小室模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，探索大黃素抑制MHCC-97H細(xì)胞侵襲的效應(yīng)。4.通過(guò)West

5、ern Blot技術(shù)檢測(cè)大黃素作用后肝癌細(xì)胞MAPK、AKT等信號(hào)通路的p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-P38、P38、p-AKT、AKT等關(guān)鍵蛋白分子的變化，同時(shí)測(cè)定與細(xì)胞侵襲遷移密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9以及細(xì)胞凋亡相關(guān)分子cleaved caspase-3，9及pro-caspase-3，9等的變化，探究大黃素抑制肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及誘導(dǎo)其凋亡的相關(guān)信號(hào)通路及具體作用的分子機(jī)制。5.將S

6、MMC-7721細(xì)胞種植至裸鼠右下肢皮下，建立裸鼠肝癌皮下瘤模型，通過(guò)腹腔注射不同濃度的大黃素溶液，觀察大黃素肝癌裸鼠皮下瘤生長(zhǎng)的抑制情況，并將腫瘤標(biāo)本通過(guò)HE染色、免疫組織化學(xué)檢測(cè)PCNA、Ki-67的表達(dá)及TUNEL等探索大黃素誘導(dǎo)體內(nèi)肝癌細(xì)胞凋亡的效應(yīng)，最后通過(guò)檢測(cè)裸鼠血液標(biāo)本的谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、堿性磷酸酶、肌酐、尿素氮等指標(biāo)研究Emodin對(duì)裸鼠肝腎功能的影響以明確其安全性。
　　結(jié)果:1.MTT實(shí)

7、驗(yàn)表明大黃素具有抑制MHCC-97H細(xì)胞增殖的作用，且呈時(shí)間及劑量依賴性，但在大黃素濃度小于50μmol/L且刺激時(shí)間小于24 h時(shí)其作用效果較弱。2.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示大黃素能劑量依賴性地誘導(dǎo)MHCC-97H細(xì)胞凋亡，但當(dāng)大黃素劑量小于50μmol/L時(shí)其作用較小。3.Transwell小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在大黃素小于50μmol/L的條件下能有效抑制MHCC-97H細(xì)胞的遷移和侵襲。4.50μmol/L的大黃素能有效抑制MMP-2、MMP-

8、9的表達(dá)，且呈時(shí)間依賴性，同時(shí)能抑制p-ERK1/2、p-AKT的表達(dá)但刺激p-P38的上調(diào)，而總的ERK1/2、AKT、P38表達(dá)沒(méi)有明顯變化。因此推斷大黃素抑制MHCC-97H細(xì)胞的遷移和侵襲與抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá)有關(guān)，且可能是通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK及AKT信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。5.CCK8實(shí)驗(yàn)表明大黃素能劑量、時(shí)間依賴性地抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖。而細(xì)胞流式術(shù)則表明其能劑量依賴性地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。6.100μmol/L的大黃

9、素能有效抑制p-AKT及輕微抑制p-JNK蛋白的表達(dá)，但同時(shí)激活了p-ERK1/2、p-P38蛋白而對(duì)總的AKT、JNK、ERK1/2、P38無(wú)明顯作用。同時(shí)能有效促進(jìn)cleaved caspase-3，9并輕微抑制pro-caspase-3，9的表達(dá)。7.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大黃素能有效抑制裸鼠肝癌的生長(zhǎng)而不影響裸鼠的體重，H&E染色結(jié)果表明大黃素能促進(jìn)腫瘤組織凋亡壞死，而免疫組化結(jié)果顯示大黃素能有效抑制Ki-67、PCNA的表達(dá)并升高T

10、UNEL細(xì)胞染色的陽(yáng)性率，驗(yàn)證了大黃素在體內(nèi)亦具有抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的效應(yīng)。8.通過(guò)肝腎功能指標(biāo)的檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)大黃素沒(méi)有損害荷瘤裸鼠的肝功能及腎功能，提示大黃素抗肝癌無(wú)明顯毒副作用。
　　結(jié)論:1.大黃素在低劑量作用下能有效抑制肝癌細(xì)胞MHCC-97H的遷移及侵襲，其分子機(jī)制與調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9的表達(dá)及MAPK、AKT信號(hào)通路相關(guān)。2.大黃素在高劑量時(shí)能有效誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的凋亡，其機(jī)制可能與激活