全反式視黃酸通過RARγ蛋白調(diào)控PPARγ2蛋白抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化.pdf

1、目的：
　　研究全反式視黃酸（All-trans retinoic acid,atRA）抑制大鼠來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rBMSCs）成脂分化過程中，視黃酸核受體γ（RARγ）對過氧化物酶體增殖激活受體γ2（PPARγ2）、CCAAT增強子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）調(diào)控的機制。
　　方法：
　　取18d左右的SD幼鼠，經(jīng)體外分離、培養(yǎng)、再成脂誘導(dǎo)rBMSCs。成脂分化誘導(dǎo)液中，分別加入0.5、1.0μmol/L atR

2、A持續(xù)作用15d后，取六孔板細(xì)胞提取RNA，Real-time PCR檢測三個處理組（0、0.5、1.0μmol/L atRA）細(xì)胞的RARγ、C/EBPα、PPARγ2的mRNA表達(dá)水平；分別加入1.0、5.0μmol/L atRA持續(xù)作用15d，取六孔板細(xì)胞提取總蛋白，Western-blot檢測三個處理組（0、1.0、5.0μmol/L atRA）細(xì)胞 RARγ、C/EBPα、PPARγ2的蛋白表達(dá)水平。重組腺病毒過表達(dá)RARγ（

3、over-RARγ）、沉默RARγ（si-RARγ）分別感染BMSCs，采用Real-time PCR及Western-blot檢測RARγ、C/EBPα、PPARγ2的mRNA及蛋白水平。Co-IP檢測1.0μmol/L at-RA持續(xù)成脂誘導(dǎo)BMSCs15d后，取兩處理組培養(yǎng)皿細(xì)胞，按照相關(guān)步驟，提取蛋白，Western-blot免疫印跡顯示結(jié)果，明確RARγ與PPARγ2兩者之間是否有相互作用。
　　結(jié)果：
　?。?）

4、視黃酸信號通路RARγ的表達(dá)水平：Real-time PCR顯示：在誘導(dǎo)15d結(jié)束時，與對照組相比，加入0.5、1.0μmol/L atRA后，RARγ表達(dá)明顯增加(P＜0.01,P＜0.001)，且呈濃度依賴性。Western-blot結(jié)果顯示：在誘導(dǎo)15d結(jié)束時，與對照組相比，加入1.0、5.0μmol/L atRA后，RARγ表達(dá)明顯增加(P＜0.01,P＜0.001)，同樣也呈濃度依賴性。過表達(dá)RARγ組：RARγmRNA和蛋白

5、均較對照組明顯增加(P?0.01)。沉默RARγ組：RARγ蛋白較對照組明顯減低。
　?。?）成脂信號通路PPARγ2及C/EBPα的表達(dá)情況：Real-time PCR顯示：在誘導(dǎo)15d結(jié)束時，與對照組相比，加入0.5、1.0μmol/L atRA后，PPARγ2、C/EBPα表達(dá)明顯降低(P＜0.001)。Western-blot結(jié)果顯示：在誘導(dǎo)15d結(jié)束時，與對照組相比，加入1.0、5.0μmol/L atRA后，PPARγ

6、2、C/EBPα表達(dá)明顯降低(P＜0.001)。過表達(dá)RARγ組：PPARγ2、C/EBPα mRNA和蛋白均較對照組明顯降低(P＜0.05,P＜0.01)。沉默RARγ組：PPARγ2、C/EBPα卻無明顯變化。
　　(3)免疫共沉淀（Co-IP）結(jié)果提示：RARγ與PPARγ2蛋白之間有蛋白-蛋白作用，可能形成復(fù)合物，未發(fā)現(xiàn)其與RARE（視黃酸反應(yīng)元件）相結(jié)合證據(jù)。
　　結(jié)論：
　　(1)atRA抑制rBMSCs成