脾虛痰濕證大鼠肝臟線粒體的功能和比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、背景：
　　中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“脾”是“氣血生化之源，后天之本”，主要功能是運(yùn)化水谷精微和水液，以保證機(jī)體得到充足的能量供應(yīng)，維持體內(nèi)水液正常代謝。長(zhǎng)期飲食肥高厚味（高熱量食物）能夠?qū)е缕⑦\(yùn)化功能失代償，機(jī)體能量代謝異常，以及異常代謝物質(zhì)堆積在體內(nèi)不能及時(shí)代謝排出體外，引起中醫(yī)證候痰濕。線粒體是細(xì)胞內(nèi)呼吸和能量產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，通過(guò)氧化磷酸化過(guò)程產(chǎn)能為細(xì)胞代謝活動(dòng)提供能量，維持生命活動(dòng)的正常進(jìn)行。線粒體氧化磷酸化產(chǎn)能過(guò)程與中醫(yī)“脾”運(yùn)化功能

2、有許多共同之處，1987年劉友章教授首次提出“中醫(yī)脾-線粒體”相關(guān)理論，指出脾主運(yùn)化不僅指是食物在消化道吸收，更重要的是指在線粒體內(nèi)的氧化磷酸化過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)脾虛證患者線粒體結(jié)構(gòu)和功能存在異常，證實(shí)中醫(yī)脾和線粒體存在聯(lián)系。
　　目的：
　　1.根據(jù)脾虛痰濕證臨床病癥制定的脾虛痰濕證大鼠模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，確定脾虛痰濕證模型復(fù)制的方法。
　　2.分析脾虛痰濕證大鼠肝臟病理變化，為脾虛痰濕證提供病理診斷依據(jù)。
　　3.揭示

3、脾虛痰濕疾病狀態(tài)下線粒體功能變化，從現(xiàn)代分子生物學(xué)角度探討脾運(yùn)化失常與線粒體的關(guān)系。
　　4.篩查線粒體蛋白質(zhì)組，初步了解脾虛痰濕證大鼠肝臟線粒體蛋白質(zhì)變化，從整體角度闡述線粒體蛋白質(zhì)異常與線粒體功能變化的關(guān)系，從而揭示脾虛痰濕證發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)理。
　　方法：
　　1.高脂飼料喂養(yǎng)SPF級(jí)SD雄性成年大鼠，監(jiān)測(cè)大鼠脾虛痰濕證相關(guān)癥狀表現(xiàn)。運(yùn)用代謝籠檢測(cè)24h飲食量，曠場(chǎng)試驗(yàn)評(píng)價(jià)精神狀態(tài)，抓力計(jì)檢測(cè)肌張力，同時(shí)觀察檢

4、測(cè)大鼠皮毛、體重和血脂，根據(jù)類人癥狀模型標(biāo)準(zhǔn)確定大鼠是否出現(xiàn)脾虛痰濕證。
　　2.記錄大鼠肝臟外觀和重量，組織病理切片HE染色觀察肝細(xì)胞形態(tài)變化，結(jié)合生化血脂指標(biāo)分析脾虛痰濕證與脂肪肝的聯(lián)系。
　　3.差速離心法粗提肝臟組織線粒體，用于線粒體功能檢測(cè);Percoll分離液純化線粒體，Western blotting檢測(cè)線粒體提取效果，用于線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)研究。
　　4.Real-time PCR測(cè)定線粒體DNA(mtD

5、NA)相對(duì)拷貝數(shù)。
　　5.運(yùn)用試劑盒檢測(cè)脾虛痰濕證大鼠肝臟線粒體膜電位和ATP含量變化。
　　6.分光光度法檢測(cè)線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ-Ⅳ活性，ATP合酶試劑盒檢測(cè)線粒體ATP合酶活性，評(píng)價(jià)脾虛痰濕證大鼠肝臟線粒體氧化磷酸化功能變化。
　　7.同重同位素相對(duì)與絕對(duì)定量（iTRAQ）技術(shù)、Mascot軟件和UniprotRat數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)線粒體蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒別定量對(duì)比分析，查找脾虛痰濕證脾運(yùn)化失常與線粒體異常的相關(guān)性蛋白質(zhì)，運(yùn)

6、用GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能分析。
　　8.Western blotting檢測(cè)線粒體蛋白質(zhì)ATP5A、TFAM、Ndufa5和CYTB表達(dá)量，驗(yàn)證iTRAQ鑒定蛋白質(zhì)組的結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　1.高脂飼料喂養(yǎng)SPF級(jí)SD雄性大鼠16周后，出現(xiàn)體質(zhì)肥胖、食欲下降、精神疲乏活動(dòng)減少、皮毛顏色枯黃無(wú)光澤等脾虛痰濕證癥狀。
　　2.高脂飼養(yǎng)16周后，脾虛痰濕證大鼠血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇含量增加，肝臟外觀肥大油膩，病

7、理顯示肝細(xì)胞內(nèi)含有大量大小不等的脂肪空泡和肝細(xì)胞玻璃樣變伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)纖維化。
　　3.運(yùn)用差速離心法加percoll分離液純化得到的線粒體基本不含胞漿蛋白，適用于線粒體蛋白質(zhì)組研究。
　　4.與正常組對(duì)比，脾虛痰濕證大鼠肝臟線粒體DNA拷貝數(shù)減少，膜電位下降，ATP含量減少，呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ和Ⅲ活性下降，復(fù)合體Ⅱ、Ⅳ和ATP合酶無(wú)明顯變化，線粒體數(shù)量無(wú)變化。
　　5.對(duì)純化的線粒體蛋白質(zhì)組鑒定對(duì)比分析得到61個(gè)脾

8、虛痰濕證大鼠差異表達(dá)蛋白質(zhì)，顯著上調(diào)30個(gè)，顯著下調(diào)31個(gè)，主要涉及線粒體氧化磷酸化和脂質(zhì)代謝、脂肪酸氧化和乙酰輔酶A代謝過(guò)程，并且與氧化磷酸化過(guò)程相關(guān)的11個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)量均下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.長(zhǎng)期高脂飲食能夠?qū)е麓笫笃⑦\(yùn)化失常出現(xiàn)脾虛痰濕證，并且為非酒精性脂肪肝型脾虛痰濕證。
　　2.脾虛痰濕證大鼠線粒體功能損傷，證明脾運(yùn)化失常與線粒體功能異常密切相關(guān)。
　　3.線粒體氧化磷酸化相關(guān)蛋白表達(dá)量下調(diào)與線粒