阻斷吡娜地爾后處理大鼠心肌線粒體比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究.pdf

1、目的：
　　 建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，觀察5-羥葵酸阻斷吡那地爾后處理對(duì)缺血再灌注損傷大鼠心臟功能的影響，利用蛋白組學(xué)研究技術(shù)觀察心肌線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。
　　 方法：
　　 1.建立Langendorff大鼠離體心臟缺血再灌注損傷模型：將24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組(Nor)、缺血再灌注損傷組(I/R)、吡那地爾后處理組(Pina)、5-羥葵酸阻斷吡那地爾后處理組(5-HD+Pina)，每組8只

2、：
　　 各組灌注方案：Nor組：持續(xù)灌注Kerbs-Henseleit緩沖液(K-H液)120 min，無缺血再灌注損傷。I/R組、Pina組、5-HD+Pina組，缺血前灌注K-H液平衡20min后，灌注4℃ ST.Thomas停跳液，使全心停跳缺血40 min，分別按以下方案續(xù)灌：I/R組：灌注K-H液60 min；Pina組：灌注K-H液前給予50μmol/L吡那地爾2 min，繼之K-H液58min；5-HD+Pina

3、組：依次灌注100μmol/L5-羥葵酸3min、50μmol/L吡那地爾2 min、K-H液55 min。記錄各組平衡末和續(xù)灌末心率(HR)、左室發(fā)展壓(LVDP)、左室舒張末壓(LVDEP)、以及最大dp/dt等心功能的變化，并收集心室肌組織：
　　 2.差速離心及Nycodenz密度梯度離心提取、純化大鼠心肌線粒體，并利用Western blot檢測(cè)亞細(xì)胞器標(biāo)識(shí)物以驗(yàn)證其純度；
　　 3.Pina組與5-HD+Pi

4、na組心肌線粒體蛋白行雙向凝膠電泳(2-DE)、染色、凝膠掃描后獲得2-DE圖像，以PD-Quest8.0軟件分析各組差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，并將各蛋白點(diǎn)挖取、酶解、質(zhì)譜分析后獲得差異蛋白的譜圖；
　　 4.利用Western blot回復(fù)驗(yàn)證關(guān)鍵差異蛋白的表達(dá)趨勢(shì)，以判斷2-DE結(jié)果的可靠性。
　　 結(jié)果：
　　 1.利用Nycodenz密度梯度離心法進(jìn)一步的提高了線粒體的純度；
　　 2.平衡末各組間心功能無

5、明顯差異，灌注末Nor組及Pina組的心功能明顯好于I/R組和5-HD+Pina組(P<0.05)，5-HD+Pina組與I/R組間心功能差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　 3.兩組蛋白進(jìn)行2-DE，得到聚焦良好、相似性高的圖像，在兩組膠上平均檢測(cè)出485±22個(gè)蛋白斑點(diǎn)；經(jīng)分析后得到9個(gè)差異大于2倍以上的蛋白點(diǎn)，質(zhì)譜分析成功獲得差異蛋白譜圖；
　　 4.通過分析，與Pina組比較在5-HD+Pina組表達(dá)下降的分別為：Spot5

6、202、5205(NADH脫氫酶1α亞復(fù)合物10亞基，NDUFA10)，Spot6001(ATP合酶α亞基，ATPA)；表達(dá)升高的6個(gè)蛋白分別為：Spot2404(長鏈脂酰輔酶A脫氫酶，ACADL)，Spot5301(NADH脫氫酶1α亞復(fù)合物10亞基，NDUFA10)，Spot5402(NADH脫氫酶鐵-硫蛋白2，NDUFS2)，Spot5503(乙醛脫氫酶2，ALDH2)，Spot6603(二氫硫辛酰胺轉(zhuǎn)乙酰酶，丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的

7、組成部分，ODP2)，Spot6807(線粒體內(nèi)膜蛋白，IMMT)。其中Spot5202、5205、5301經(jīng)質(zhì)譜鑒定均為NDUFA10，兩個(gè)表達(dá)下調(diào)，一個(gè)表達(dá)升高。
　　 5.Western blo回復(fù)驗(yàn)證，在5-HD+Pina組中NDUFA10、NDUFS2及ALDH2較Pina組升高，ATPA較Pina組下降，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.吡那地爾后處理能明顯改善大鼠心臟功能

8、，而5-羥葵酸可部分拮抗其保護(hù)作用；
　　 2.5-羥葵酸阻斷吡那地爾后處理(線粒體敏感性心通道的開放被阻斷)，可導(dǎo)致：
　　 ①心肌細(xì)胞發(fā)生缺血再灌注損傷引起ATPA表達(dá)下調(diào)，其原因可能是ATPA的轉(zhuǎn)運(yùn)尤其是跨膜過程受損；Pina可以維持線粒體內(nèi)ATPA的穩(wěn)定表達(dá)；
　　 ②ACADL、NDUFS2、ODP2、IMMT、ALDH2表達(dá)上調(diào)；可能是由于線粒體內(nèi)H+增加、pH升高、ATP合成減少、醛類物質(zhì)堆積等原因