白菜花粉發(fā)育與授粉受精相關(guān)基因BcAHA8的表達分析及BcSKS11的功能鑒定.pdf

1、花粉發(fā)育及后續(xù)的授粉受精過程涉及復雜的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡。近年來，由于模式植物擬南芥基因組測序的完成，基因組數(shù)據(jù)的不斷增加伴隨生物信息學的迅速發(fā)展，為研究植物花粉發(fā)育及授粉受精過程相關(guān)基因表達和調(diào)控模式奠定了基礎。本實驗室采用ATH1芯片分析白菜（Brassica campestrisL.ssp.chinensis Markino var.communis Tsen et Lee）ajhGMS‘Bcajh97-01A/B'花蕾的基因差異表

2、達基因時，檢測到一批花粉發(fā)育和授粉受精過程特異表達的相關(guān)基因。這些基因在白菜mmc對應的野生型中上調(diào)表達，也在授粉后的雌蕊中上調(diào)表達（蔣晶晶等，未發(fā)表）。其中轉(zhuǎn)錄本為At3g42640的基因編碼植物質(zhì)膜H+-ATPase，其白菜同源基因可能作用于花粉發(fā)育及授粉受精過程。植物質(zhì)膜H+-ATPase參與物質(zhì)的次級跨膜轉(zhuǎn)運、氣孔的開閉、細胞的伸長生長以及植物對環(huán)境脅迫的響應等生理過程，被喻為植物生命活動的“主宰酶”。突變生物學研究發(fā)現(xiàn)編碼質(zhì)膜

3、運載體的基因在花粉發(fā)育、授粉受精、環(huán)境脅迫等過程中發(fā)揮著重要作用。但目前對于編碼植物質(zhì)膜H+-ATPase這類運載體的基因描述相對較少，具體所執(zhí)行的功能更不得而知。另一個基因BcSKS11編碼的蛋白質(zhì)是一個多銅氧化酶，前期的研究結(jié)果表明其在成熟花粉及授粉后的嫩角果中表達，推測其作用于花粉發(fā)育及授粉受精過程。為了描述白菜At3g42640同源基因的結(jié)構(gòu)和表達特征，為進一步探究其功能打下基礎,本研究利用同源擴增的方法克隆基因全長，分析其序列

4、結(jié)構(gòu)特征并預測其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，同時采用RT-PCR或qRT-PCR方法分析其在可育株系和不育株系不同發(fā)育階段花蕾和授粉前后雌蕊的表達情況，采用組織原位雜交進行該基因的細胞定位，分析其與花粉發(fā)育及授粉受精的關(guān)系;同時，為研究BcSKS11基因的功能，我們通過構(gòu)建反義RNA表達載體，利用農(nóng)桿菌介導的方法導入菜心中，對獲得的KanR植株進行分子、形態(tài)和細胞學的檢測，從而初步分析其功能。取得的主要結(jié)果如下:
　　 (1)利用同源擴增

5、的方法擴增獲得了At3g42640在白菜中的同源基因的cDNA全長。cDNA全長為3199 bp，其中ORF為2847bp。該基因編碼該基因編碼948個氨基酸，對其蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進行預測，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)含有41.9％的α螺旋，9.8％的β折疊和48.3％的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。SMART對所推測氨基酸的功能域進行預測發(fā)現(xiàn)具有典型的H+-ATPase運載體的結(jié)構(gòu)域Cation_ATPase_N、E1-E2_ATPase，說明這是一個典型的H+-ATP

6、ase運載體基因。該基因與擬南芥中AHA8編碼的氨基酸序列比較，發(fā)現(xiàn)具有相同的特征，同源性高，故將其命名為Brassica campestris AHA8(BcAHA8。
　　 (2)利用半定量RT-PCR對白菜核隱性不育兩用系‘Bajh97-01A/B'的不育株系的根、莖、葉、雌蕊、角果、花的表達情況進行分析，發(fā)現(xiàn)BcAHA8只在花中表達;對不育和可育株系Ⅰ～Ⅴ級花莆進行表達分析，只在可育系的Ⅴ級花蕾表達。進而對可育株系的花器

7、官組織花瓣、萼片、花絲、雄蕊中BcAHA8的表達情況進行了檢測，結(jié)果表明BcAHA8在雄蕊中表達量最高，萼片次之，花瓣中有微量表達;在授粉后的嫩角果中BcAHA8持續(xù)表達。利用實時定量RT-PCR對BcAHA8有表達的器官和組織進行了定量分析，結(jié)果表明授粉后的嫩角果中BcAHA8在2h時表達量最高，隨后下降，在24 h時有升高的趨勢。同時BcAHA8在雄蕊中表達量最高，開放花和5級花蕾次之。原位雜交技術(shù)分析了BcAHA8在可育株系Ⅰ～Ⅴ