白菜花粉發(fā)育相關(guān)基因BcMF13和BcMF14的分離及其功能驗(yàn)證.pdf

1、十字花科蔬菜是我國栽培面積最大、總產(chǎn)量最高、雜種優(yōu)勢(shì)利用最為普遍的蔬菜之一。發(fā)掘和創(chuàng)建其雄性不育系在生產(chǎn)實(shí)踐中具有重要意義，一直以來深受人們重視。但是，雄性不育的產(chǎn)生機(jī)制仍然是一個(gè)尚未完全解開的謎，目前對(duì)其的認(rèn)識(shí)是零散和不完全的，許多問題還有待深入研究?；ǚ郯l(fā)育相關(guān)基因的克隆和分析有助于通過反義技術(shù)等阻斷與花粉發(fā)育有關(guān)基岡的表達(dá)從而獲得雄性不育植株。這些分子生物學(xué)理論與技術(shù)的應(yīng)用，不僅為最終闡明植物雄性不育機(jī)制提供了條件，也將大大推動(dòng)十

2、字花科作物和其他農(nóng)作物雜種優(yōu)勢(shì)的有效應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)室采用 cDNA-AFLP技術(shù)從白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis Markino,syn.B.rapa ssp.chinensis)減數(shù)分裂胞質(zhì)分裂突變體mmc(male meiotic cytokinesis)的野生型(可育株)中分離到兩個(gè)與花粉育性密切相關(guān)的差異片段A8T4和A9T15，本研究以其為研究對(duì)象，通過PCR擴(kuò)增方法對(duì)其基岡組全長和

3、cDNA全長進(jìn)行克降、鑒定，以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測(cè)，并以十字花科不同種屬的植物為材料進(jìn)行同源序列克隆、鑒定，并構(gòu)建分子進(jìn)化樹，探討其進(jìn)化關(guān)系。并運(yùn)用反義和RNA干涉技術(shù)，對(duì)菜心［B.campestris L.ssp.chinensis Markino var.parachinensis(Bailey)Tsen et Lee]進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以獲得這兩個(gè)基因功能缺失突變體，從而分析其在花粉發(fā)育進(jìn)程中的生物學(xué)功能。獲得的主要結(jié)果如下：

4、 (1)根據(jù)差異片段A8T4和A9T15序列設(shè)計(jì)引物，利用RACE技術(shù)獲得花粉發(fā)育相關(guān)基因的cDNA和DNA序列全長，分別命名為Brassica campestris Male Fertility 13 (BcMF13)和Brussicacampestris Male Ferility 14 (BcMF14)。序列分析表明，BcMF13的cDNA序列全長為600 bp，含有2個(gè)外顯子和1個(gè)長度為106 bp的內(nèi)含子。cDNA序列的最大開

5、放閱讀框(open reading frame,ORF)為222 bp，編碼73個(gè)氨基酸。在GenBank數(shù)據(jù)庫中沒有發(fā)現(xiàn)與BcMF13同源性很高的基因，表明BcMF13是一個(gè)新基因。BcMF13在可育株系‘Bajh97-01/B’的的IV～V級(jí)花蕾中特異表達(dá)，尤其在雄蕊中表達(dá)量很高，在不育株系‘Bajh97-01A’中不表達(dá)，并且EST數(shù)據(jù)庫中相似性很高的序列都來源于蕓薹屬的生殖器官，因此初步推斷BcMF13很可能參與蕓薹屬花粉的發(fā)育

6、過程。BcMF14的ORF為240個(gè)堿基，編碼79個(gè)氨基酸，軟件分析表明BcMF14的核酸序列和編碼的BcMF14序列均符合RALF的特征，表明該基因是白菜中快速堿化因子類信號(hào)分子。 (2)根據(jù)BcMF13的全長序列設(shè)計(jì)引物，在十字花科蕓薹屬植物的8個(gè)物種中克隆到BcMF13的同源序列，BcMF13同源基岡在核苷酸水平和氨基酸水平相似性分別為80.0％～96.9％和96.7％～99.9％。在序列同源比對(duì)的基礎(chǔ)上，基于Kimura

7、雙參數(shù)距離，構(gòu)建了BcMF13同源基因在蕓薹屬植物8個(gè)物種中的NJ、ME和MP分子進(jìn)化樹，3種分子樹的拓?fù)鋱D總體趨勢(shì)相同，有較高的一致性，表明用 BcMF13序列得到的系統(tǒng)樹能客觀地反映BcMF13類基因在這些物種中的進(jìn)化關(guān)系。 (3)根據(jù)白菜BcMF14的全長序列設(shè)計(jì)引物，分別在十字花科5個(gè)屬17份材料中擴(kuò)增劍BcMF14的同源序列，表明該基因在十字花科植物中廣泛存在，進(jìn)一步擴(kuò)大了快速堿化因子的基因家族成員。并且這17個(gè)同源基

8、因在核苷酸水平和氨基酸水平均有很高的相似性，編碼的氨基酸都含有快速堿化因子蛋白的特征：一個(gè)保守的“YIXY”區(qū)和4個(gè)保守的斗胱氨酸殘基。說明該基因在十字花科植物中進(jìn)化速度較慢，它們可能在其發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。 (4)利用BcMF13構(gòu)建了含有組成型啟動(dòng)子CaMV35S的RNA反義載體pB135S-AMF13和干涉載體pBI35S-RMF13，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將構(gòu)建的BcMF13反義載體和干涉載體導(dǎo)入菜心中，分別獲得了

9、BcMF13的反義和干涉菜心轉(zhuǎn)基因植株。利用BcMF14構(gòu)建了含有組成型啟動(dòng)了 CaMV35S的RNA反義載體pBI35S-AMF14和含有絨氈層特異表達(dá)啟動(dòng)子BcA9的RNA反義載體pBIBcA9-AMF14，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將構(gòu)建的BcMF14的反義載體導(dǎo)入菜心中，獲得了反義BcMF14菜心轉(zhuǎn)基因植株。 (5)用BcMF13 cDNA序列作探針的Northern雜交結(jié)果表明，BcMF13在含有CaMV35S啟動(dòng)了的反義

10、載體和干涉載體的菜心轉(zhuǎn)基因植株花蕾中的表達(dá)比對(duì)照都有降低，而干涉載體比反義載體對(duì)BcMF13表達(dá)水平的降低程度要人一些，說明干涉技術(shù)對(duì)白菜BcMF13的沉默效果要好于反義技術(shù)。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)BcMF13受到反義和干涉抑制后，使花粉的發(fā)育在減數(shù)分裂前期就出現(xiàn)異常，在四分體時(shí)期小孢子和絨氈層細(xì)胞受到嚴(yán)重影響，從而導(dǎo)致正常的成熟花粉數(shù)量銳減?；ǚ勖劝l(fā)實(shí)驗(yàn)表明，pBI35S-AMF13菜心轉(zhuǎn)基因植株花粉的萌發(fā)率為34.23％，顯著低于對(duì)照的7

11、8.17％，而掃描電鏡下的花粉畸形率達(dá)到54.66％。這種情況在轉(zhuǎn)干涉基因的菜心植株中更明顯：pBI35S-RMF13菜心轉(zhuǎn)基因植株花粉的萌發(fā)率只有26.27％；花粉畸形率比轉(zhuǎn)反義基因的稍高，達(dá)到57.55％。柱頭萌發(fā)比體外萌發(fā)更能說明花粉止常與否，對(duì)受精后的柱頭進(jìn)行苯胺藍(lán)染色觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因菜心的花粉管在柱頭中的生長速度明顯減慢。 (6)用BcMF14 300-bp長的cDNA序列作探針，對(duì)菜心轉(zhuǎn)基因植株大花蕾的Northern

12、雜交結(jié)果表明，BcMF14在含有不同啟動(dòng)子反義載體的轉(zhuǎn)基因菜心中的表達(dá)都受到不同程度的抑制，其中pBIBcA9-AMF14比pBI35S-AMF14的反義轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量降低幅度更明顯，說明BcA9啟動(dòng)子對(duì)BcMF14反義基因在花蕾中的啟動(dòng)效果要優(yōu)于CaMV35S啟動(dòng)子。BcMF14的表達(dá)受到了抑制，一方面說明BcMF14為一在花粉中起作用的RALF基因，另一方面也驗(yàn)證了CaMV35S啟動(dòng)子在菜心花粉中具有啟動(dòng)活性。在對(duì)菜心轉(zhuǎn)BcM

13、F14反義基因植株和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株的細(xì)胞學(xué)觀察和透射電鏡的觀察中均發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照株在四分體時(shí)期以前的小孢子發(fā)育階段沒有明顯籌別，而兩種轉(zhuǎn)基因菜心花粉在發(fā)育到四分體階段都出現(xiàn)異常，說明BcMF14很可能作用在白菜小孢子發(fā)育的四分體時(shí)期。BcMF14除了直接影響小孢子發(fā)育以外，還對(duì)絨氈層的發(fā)育產(chǎn)生了影響。推測(cè)BcMF14基岡在小孢子和絨氈層之間的信號(hào)、物質(zhì)聯(lián)絡(luò)中有一定的作用。pBI35S-AMF14、pBIBoA9-AMF14反義

14、載體菜心轉(zhuǎn)基因植株花粉在掃描電鏡下的花粉畸形率分別為48.95％和51.2％，花粉的體外萌發(fā)率分別為44.39％和26.09％，花粉在柱頭上的萌發(fā)和對(duì)照相比，只有部分花粉管能生長到達(dá)花柱底部，這表明反義技術(shù)使得BcMF14的表達(dá)量降低，導(dǎo)致花粉發(fā)育異常，產(chǎn)生大量畸形花粉。最終導(dǎo)致花粉萌發(fā)率下降。這表明快速堿化因子類基因家族中的確存在一些調(diào)控植物花粉發(fā)育的 RALF 信號(hào)分子。這與 Bedinger 等對(duì)在番茄花粉中特異表達(dá)的 PRALF