弱毒突變體對(duì)煙草脈帶花葉病毒的交叉保護(hù)作用.pdf

1、交叉保護(hù)是指一種病毒侵染植株后可阻止相同病毒的不同株系或親緣關(guān)系較近的另一種病毒侵染該植株的現(xiàn)象。交叉保護(hù)對(duì)病毒病的防治效果非常明顯，已成功地用來(lái)防治番茄花葉病、柑橘衰退病、番木瓜環(huán)斑病、黃瓜花葉病和西葫蘆黃色花葉病等多種病毒病。但交叉保護(hù)作為一種常規(guī)防治方法仍存在一定缺陷:弱毒株系有突變?yōu)閺?qiáng)毒株系的風(fēng)險(xiǎn)，弱毒株系可能與其它病毒有協(xié)生作用從而造成嚴(yán)重的損失，弱毒株系有可能傳播到非靶標(biāo)寄主上造成危害。針對(duì)以上問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)對(duì)煙草脈帶花葉病毒

2、（Tobaccovein banding mosaic virus，TVBMV）輔助成分-蛋白酶(Helper component-proteinase，HC-Pro)中調(diào)控致病力、協(xié)生和蚜蟲傳毒的氨基酸進(jìn)行突變，獲得多位點(diǎn)突變、與PVX無(wú)協(xié)生作用、不能蚜傳的弱毒突變體。本文主要結(jié)果如下:
　　 1.構(gòu)建了分別含有兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)氨基酸突變的弱毒突變體共10個(gè)，病毒致病力進(jìn)一步下降，濃度降低。TVBMV HC-Pro中的NRT突

3、變?yōu)锳RT(B)、FRNK突變?yōu)镕INK(C)、CDN突變?yōu)镃KN(D)、IQN突變?yōu)镈EN(E)，可顯著降低TVBMV的致病力和植株體內(nèi)的濃度，同時(shí)使其喪失與PVX的協(xié)生能力。而HC-Pro中RITC突變?yōu)镋ITC(A)，TVBMV不能經(jīng)由蚜蟲傳播。本論文利用定點(diǎn)突變技術(shù)，將上述突變引入攜帶gfp的TVBMV侵染性克隆pCamTVBMV，獲得四個(gè)雙位點(diǎn)突變體BC、BD、CE、DE，四個(gè)三位點(diǎn)突變體ACE、ADE、BCE、BDE，兩個(gè)四

4、位點(diǎn)突變體ABCE、ABDE。
　　 利用農(nóng)桿菌浸潤(rùn)法接種本氏煙（Nicotiana benthamiana），5-7天后野生型TVBMV產(chǎn)生脈明癥狀，新生葉片畸形，紫外燈下可見(jiàn)強(qiáng)烈的綠色熒光，后期頂部葉片嚴(yán)重畸形，植株不再生長(zhǎng)。而多位點(diǎn)突變體接種的本氏煙上未出現(xiàn)明顯癥狀，熒光強(qiáng)度明顯降低或觀察不到。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，突變體在植株中積累量很低，遠(yuǎn)低于野生型。RT-PCR檢測(cè)證明在接種的本氏煙系統(tǒng)葉片中可以檢測(cè)到病毒RNA。

5、多位點(diǎn)突變體可系統(tǒng)侵染普通煙，但不產(chǎn)生明顯癥狀。
　　 2.弱毒突變體與PVX(Potato virus X, PVX)無(wú)協(xié)生作用。將攜帶TVBMV弱毒突變體與野生型PVX的農(nóng)桿菌GV3101培養(yǎng)液等體積混合后，共浸潤(rùn)本氏煙和普通煙。野生型TVBMV和PVX復(fù)合侵染本氏煙，引起本氏煙的系統(tǒng)壞死，而TVBMV多位點(diǎn)突變體與PVX共浸潤(rùn)本氏煙只是產(chǎn)生花葉癥狀，與單獨(dú)注射PVX的本氏煙癥狀相近。ELISA檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)，多位點(diǎn)突變體與

6、PVX共浸潤(rùn)本氏煙后，PVX CP積累量與單獨(dú)接種野生型PVX相近，顯著低于野生型TVBMV和PVX的植株中PVX的積累量。接種普通煙上的結(jié)果與本氏煙一致。這些結(jié)果表明，獲得的十個(gè)弱毒突變體喪失與PVX協(xié)生的能力。
　　 3.部分TVBMV弱毒突變體喪失蚜傳能力。將攜帶弱毒突變體ACE、ADE、ABCE和ABDE及野生型TVBMV的農(nóng)桿菌浸潤(rùn)本氏煙，20天后，將無(wú)毒蚜蟲饑餓處理2h，飼毒5 min后轉(zhuǎn)移到將健康的本氏煙上，12h

7、后噴藥將蚜蟲殺死。蚜傳后6天，取食野生型TVBMV的蚜蟲接種的本氏煙無(wú)系統(tǒng)癥狀，但紫外光下可在頂部葉片局部觀察到綠色熒光;蚜傳后8天，取食野生型TVBMV的蚜蟲接種的本氏煙頂部葉片出現(xiàn)明脈現(xiàn)象，紫外燈下可見(jiàn)葉脈布滿綠色熒光。取食弱毒突變體ACE、ADE、ABCE和ABDE的蚜蟲接種的本氏煙8天后無(wú)任何癥狀，在紫外光下觀察不到綠色熒光，RT-PCR也檢測(cè)不到病毒。這表明弱毒突變體ACE、ADE、ABCE和ABDE喪失了蚜傳能力。
　

8、　 4.多位點(diǎn)突變體對(duì)野生型TVBMV有良好的保護(hù)效果。接種本氏煙后間隔11天、7天和3天接種強(qiáng)毒，攻毒后第5天、10天和15天，在自然光下觀察本氏煙上的癥狀，在紫外燈下觀察綠色熒光強(qiáng)度和面積，并進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果表明，保護(hù)接種的本氏煙癥狀減輕，熒光強(qiáng)度減弱，病毒積累量降低，在保護(hù)期為7天時(shí)，突變體對(duì)TVBMV都有一定的保護(hù)效果，但保護(hù)期為11天時(shí)保護(hù)效果更好。在這些突變體中單位點(diǎn)突變體B、E和雙位點(diǎn)突變體BC交叉保護(hù)效果更好。