腸出血性大腸桿菌O157：H7 EspA蛋白的重組表達(dá)及生物學(xué)作用研究.pdf

1、腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli，EHEC)O157：H7是一種重要的傳染病病原菌。自1975年首次被分離、1982年被確認(rèn)為致病菌以來(lái)的20多年中，世界各地包括中國(guó)都有不同規(guī)模的暴發(fā)流行。EHECO157：H7感染可致腹瀉、出血性結(jié)腸炎(hemorrhagiccolitis，HC)，還可引發(fā)溶血性尿毒綜合征(hemolyticuremicsyndrome，HUS)及血栓性血小板減少紫癜

2、(thromboticthrombocytopenicpurpura，TTP)等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。EHECO157的感染因具有暴發(fā)流行趨勢(shì)、強(qiáng)烈的致病性與致死性和抗生素治療可加劇病情的危險(xiǎn)性等特點(diǎn)，已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。然而目前對(duì)其感染仍缺乏有效的防治方法，研究證明抗生素可促使O157菌釋放致死性志賀毒素(Stx)，從而使患者并發(fā)HUS的危險(xiǎn)性增加。 病原體和宿主的相互作用是決定感染及發(fā)病的關(guān)鍵。EHEC與宿

3、主腸道粘膜上皮細(xì)胞的粘附是疾病發(fā)展的第一步。介導(dǎo)O157細(xì)菌粘附定植的主要結(jié)構(gòu)單元是Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type-Ⅲsecretionsystem,TTSS)。Ⅲ型分泌蛋白EspA(Esp為E.colisecretedprotein縮寫(xiě))在細(xì)菌表面形成針狀擴(kuò)展結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)是繞過(guò)細(xì)胞微絨毛和粘膜層必不可少的轉(zhuǎn)移裝置，它在細(xì)菌和宿主細(xì)胞之間架起一座橋梁，多種分泌蛋白及Tir被轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞。效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)入促使O157緊密粘附至宿主細(xì)胞，引起肌動(dòng)

4、蛋白重排與聚集，導(dǎo)致宿主細(xì)胞發(fā)生病理改變，形成A/E(attaching/effacing)損傷。EspA不僅在細(xì)菌粘附中發(fā)揮關(guān)鍵性的起動(dòng)作用，也在形成A/E損傷的效應(yīng)分子傳遞中起到橋梁作用。因此研究EspA的生物學(xué)功能及其在粘附定植中的作用對(duì)闡明O157的致病機(jī)理，尋找預(yù)防、控制和治療O157感染的手段具有重要意義。 基于以上認(rèn)識(shí)，本實(shí)驗(yàn)從以下幾個(gè)方面對(duì)腸出血性大腸桿菌O157EspA生物學(xué)功能進(jìn)行了研究，取得了以下結(jié)果：

5、 1.O15/EspA的克隆表達(dá)。 采用PCR法自O(shè)157菌基因組擴(kuò)增編碼EspA的約580bp全長(zhǎng)基因，T-A克隆后構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-espA，經(jīng)酶切、測(cè)序證實(shí)與預(yù)期序列完全一致。陽(yáng)性重組子轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)后，IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)率約40％，PAGE電泳初步測(cè)定目的蛋白的分子量約21KD，超聲破菌后電泳證實(shí)目的蛋白以包涵體形式表達(dá)。目的蛋白經(jīng)包涵體洗滌和陰離子交換層析純化后純度達(dá)9

6、0％，免疫家兔獲得了效價(jià)為1：32的多抗血清。 2.O157EspA生物學(xué)作用研究。 2.1O157體外粘附細(xì)胞模型建立。選用培養(yǎng)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)周期較短、貼壁生長(zhǎng)的HeLa細(xì)胞，將O157接種于HEPES-DMEM液體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600≈0.6)，然后將貼壁生長(zhǎng)在蓋玻片上的HeLa細(xì)胞與細(xì)菌于37℃，5％CO2共同孵育4h，姬姆薩染色及電鏡觀(guān)察。結(jié)果O157與HeLa細(xì)胞緊密粘附，呈典型的LA粘附類(lèi)型。

7、 2.2采用EspA抗體與細(xì)菌預(yù)中和及細(xì)菌與抗體同時(shí)加入方法，與HeLa細(xì)胞粘附，用PBS洗去未粘附細(xì)菌，胰酶消化細(xì)胞，倍比稀釋后接種LB平板，計(jì)數(shù)單菌落，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析EspA抗體阻斷粘附的效果，結(jié)果顯示：抗體中和的O157與未加抗體的O157細(xì)菌沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)，EspA抗體并不能阻斷細(xì)菌與細(xì)胞的粘附。 2.3用EspA兔抗血清作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，檢測(cè)了O157與HeLa細(xì)胞的粘附，

8、結(jié)果提示：①重組EspA蛋白免疫的兔抗血清可以和O157細(xì)菌發(fā)生抗原抗體反應(yīng)；②O157是通過(guò)EspA介導(dǎo)與HeLa細(xì)胞的粘附。 3.EspA作為O157疫苗候選抗原的免疫保護(hù)研究。 3.1EspA-Stx2B融合蛋白的克隆表達(dá)。采用Linker連接的方式，將stx2B連接在espA之后。具體步驟為：將含BamHI酶切位點(diǎn)的Linker設(shè)計(jì)到espA的下游引物、stx2B的上游引物中，PCR擴(kuò)增獲得espA及stx2B片

9、段，通過(guò)DNA連接酶連接，構(gòu)建pET28a(+)-espA-stx2B重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，PAGE電泳檢測(cè)，融合蛋白表達(dá)率約為45％。初步純化后蛋白純度達(dá)85％。 3.2用純化后的EspA和EspA-Stx2B重組蛋白免疫BALB/c小鼠，ELISA結(jié)果顯示血清特異性抗體的效價(jià)顯著增高，表明重組蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性。O157活菌攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示EspA及EspA-Stx2B能大大

10、減少小鼠的死亡率，與對(duì)照組相比，小鼠存活率由46.7％分別提高到80％和93.3％，差異顯著(P＜0.05)。對(duì)存活小鼠糞便O157CFU計(jì)數(shù)分析表明，實(shí)驗(yàn)組與PBS對(duì)照組排菌時(shí)間未見(jiàn)明顯差異(P＞0.05)。O157超聲上清毒素致死保護(hù)試驗(yàn)顯示融合蛋白EspA-Stx2B能有效保護(hù)0.05mgO157超聲上清攻毒引起的小鼠死亡，免疫保護(hù)率為67.7％。 綜上所述，本研究成功表達(dá)了EspA和EspA-Stx2B重組蛋白，建立了O