格林-巴利綜合征患者腦脊液差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、格林-巴利綜合征(Guillain-Barre’Syndrome，GBS)又稱急性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病(acute Inflammatory demyelinating polyneuropathy，AIDP)，是累及周圍神經(jīng)(peripheral nervous system)和神經(jīng)根髓鞘的，以急性、對稱地進(jìn)行性、獲得性、炎性為特征的自身免疫性疾病。其病理特征為周圍神經(jīng)血管周圍的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤，為炎癥伴髓鞘脫失即炎性脫髓鞘。

2、是目前急性軟癱的最常見病因。在發(fā)展中國家發(fā)病率比較高，多為急性發(fā)病，預(yù)后較差。即使得到加強(qiáng)監(jiān)護(hù)，仍然有3％-7％的死亡率，此外，大約7％-15％的病人會留有神經(jīng)學(xué)上的后遺癥，如：面癱、下肢無力伴垂足、手無力和肌萎縮、植物神經(jīng)障礙等。 GBS的廣泛被接受的診斷標(biāo)準(zhǔn)仍然是描述性的，尚缺乏明確的定義和確切的診斷標(biāo)志物，其病因和免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制迄今未明。大量的實(shí)驗(yàn)證明，GBS患者腦脊液(cerebrospinal fluid CSF)中存

3、在蛋白質(zhì)的異常表達(dá)，這為我們研究GBS提供了一個(gè)獨(dú)特的窗口。到目前為止，國內(nèi)對GBS腦脊液的研究尚缺乏系統(tǒng)的研究，多停留在經(jīng)典實(shí)驗(yàn)生物學(xué)研究水平。本研究將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)體系應(yīng)用于GBS腦脊液的研究，通過優(yōu)化雙向電泳分離技術(shù)、質(zhì)譜鑒定技術(shù)、搜索大量數(shù)據(jù)庫，檢測到GBS患者與正常人腦脊液的差異蛋白，并對某些明顯的差異蛋白進(jìn)行后期的免疫學(xué)驗(yàn)證，為疾病的早期診斷、有效藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)、疾病發(fā)病機(jī)制的探討提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。 目的：建立GB

4、S患者與正常人腦脊液比較蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)研究體系，尋找并鑒定GBS患者腦脊液特異蛋白，為其發(fā)病機(jī)制提供線索，為臨床診斷和治療提供依據(jù)。 方法：分別取GBS疾病組和對照組的新鮮腦脊液，冰丙酮沉淀法提取總蛋白，進(jìn)行第一向等電聚焦電泳(IEF)和第二向十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)組，ImageMaster 2D圖像分析軟件對分析膠進(jìn)行比較分析，識別差異表達(dá)明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)。摳取制備膠上相應(yīng)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，應(yīng)

5、用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI/TOF/MS)得到肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)，搜索SWISSPROT數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)點(diǎn)。隨后對感興趣的蛋白質(zhì)點(diǎn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行免疫學(xué)驗(yàn)證。 結(jié)果：分別獲得GBS患者及正常對照組腦脊液蛋白質(zhì)組表達(dá)圖譜，識別出387±29(實(shí)驗(yàn)組)和398±36(對照組)個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。GBS患者和對照組腦脊液的雙向電泳圖譜存在明顯差異，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，10個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在兩組間存在顯著差異

6、，其中4個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在GBS疾病組中表達(dá)明顯上調(diào)，6個(gè)降低。其中Cystatin C表達(dá)下調(diào)，是改變最明顯的蛋白質(zhì)點(diǎn)，為本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)。隨后的ELISA也證實(shí)GBS患者的腦脊液中Cystatin C的濃度明顯低于對照組。 結(jié)論：本研究成功建立了應(yīng)用雙向電泳及生物質(zhì)譜方法研究GBS患者腦脊液蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)體系。識別并鑒定了10個(gè)與格林-巴利綜合征疾病有關(guān)的特異蛋白點(diǎn)，并在免疫學(xué)角度驗(yàn)證了Cystatin C表達(dá)下調(diào)。這些蛋白質(zhì)與G