結(jié)直腸腺瘤早期惡變與腺瘤患者的血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma，CRC)發(fā)病率不斷上升，我國原為結(jié)直腸癌低發(fā)區(qū)，但隨著人們生活水平的提高以及生活方式的改變，發(fā)病率趨于高發(fā)。近年來治療方法進(jìn)展迅速，但晚期患者確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移高達(dá)37％，預(yù)后仍然較差，因此早期診治至關(guān)重要。結(jié)腸鏡是可靠的篩查與診斷手段，但其價(jià)格昂貴，且具有侵入性，早期無癥狀或癥狀輕微的患者往往難以接受腸鏡檢查。而癌胚抗原(carcino—embryonic antigen，CEA)、糖

2、鏈抗原19-9(carbohydrate antigen19-9，CA199)等腫瘤標(biāo)志物敏感性與特異性較差，不適于篩查與診斷。 隨著生物標(biāo)記物在分子水平上診斷腫瘤的發(fā)生發(fā)展，人類基因組計(jì)劃的完成，高通量技術(shù)的出現(xiàn)，計(jì)算機(jī)生物學(xué)的異軍突起，尋找有效的腫瘤生物標(biāo)記物已成為腫瘤篩查和早期診斷的重要方法。腫瘤基因組學(xué)對生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)已做出重要的貢獻(xiàn)。 蛋白質(zhì)組學(xué)，研究的是整個細(xì)胞或組織的全部蛋白，能替代基因組學(xué)檢測臨床樣本。

3、細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)構(gòu)成血清或尿液中的蛋白質(zhì)譜，細(xì)胞性質(zhì)功能改變，蛋白質(zhì)譜隨之變化。因此蛋白質(zhì)組學(xué)分析能檢測臨床樣本，這為臨床早期高通量檢測提供了一種有效的方法。 作為一種新的高通量篩選技術(shù)，蛋白質(zhì)組學(xué)已迅速成為研究腫瘤標(biāo)記物、腫瘤發(fā)病機(jī)制及靶向治療位點(diǎn)的重要手段。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生并釋放各種蛋白質(zhì)分子至血液中，構(gòu)成與正常人不同的蛋白質(zhì)譜，包括了腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子改變。蛋白質(zhì)譜中的蛋白，甚至蛋白亞型的改變均可被檢測，這使得發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌敏感

4、的腫瘤生物標(biāo)記成為可能，促進(jìn)分子診斷與治療的發(fā)展。 目前公認(rèn)多基因突變誘發(fā)結(jié)直腸粘膜出現(xiàn)腺瘤性息肉，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)榍忠u性腫瘤，最終發(fā)展為轉(zhuǎn)移性癌腫，這是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的典型過程。本研究應(yīng)用雙向電泳與基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)，比較腺瘤早期惡變與腺瘤患者血清蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，初步篩選出血液中結(jié)直腸癌的早期診斷標(biāo)志物。 研究目的： 1.應(yīng)用2D—DIGE技術(shù)檢測結(jié)直腸腺瘤及腺瘤早期惡變患者血清蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，初步篩選出兩組

5、的血清差異蛋白。 2.應(yīng)用MALDI—TOF MS鑒定差異蛋白，篩選出可能作為CRC早期診斷血清腫瘤標(biāo)志物，探討CRC發(fā)病的可能機(jī)制。 研究方法： 1.臨床資料及血清標(biāo)本收集 選擇來自中山大學(xué)胃腸研究所組織庫中2007年5月至2008年5月的結(jié)直腸腺瘤及腺瘤早期惡變患者血清各8例，分別作為對照組和研究組，治療前在清晨空腹抽取血，分離血清，分裝。 2.膠內(nèi)差異雙向電泳(two dimensional

6、—difference in gel electrophoresis，2D—DIGE)分析 提取血清總蛋白，經(jīng)蛋白質(zhì)純化和定量后，進(jìn)行2D—DIGE分離。2D—DIGE凝膠中預(yù)先被Cydye染料標(biāo)記的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，經(jīng)多功能激光掃描儀不同波長的激光掃描后，獲取熒光膠內(nèi)差異蛋白表達(dá)圖譜，使用DeCyder軟件分析。比較腺瘤與腺瘤早期惡變患者血清中的蛋白質(zhì)差異。 3.差異蛋白點(diǎn)的篩選和切取 將與2D—DIGE匹配的Dee

7、p purple熒光染色的制備膠裝入全自動斑點(diǎn)處理工作站并固定，選取兩組蛋白表達(dá)差異1.5倍以上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行斑點(diǎn)處理，完成凝膠上相應(yīng)斑點(diǎn)的切取、脫色、酶切和質(zhì)譜靶點(diǎn)樣。 4.蛋白質(zhì)點(diǎn)鑒定 應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸/電離—飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Matrix assisted laser desorption/ ionization—time of flight mass spectrometry，MALDI—TOF MS)進(jìn)行蛋

8、白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋譜(peptide mass fingerprint，PMF)鑒定。 5.質(zhì)譜數(shù)據(jù)的檢索 將PMF數(shù)據(jù)進(jìn)行本地Profound檢索和在線MASCOT檢索。兩種軟件檢索數(shù)據(jù)一致的認(rèn)為是成功鑒定出的蛋白質(zhì)。對質(zhì)譜成功鑒定出的蛋白質(zhì)，將凝膠圖譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)綜合，篩選出差異蛋白質(zhì)，構(gòu)成腺瘤早期惡變血清蛋白質(zhì)譜。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.血清蛋白質(zhì)濃度 兩組血清蛋白質(zhì)經(jīng)過提取和純化后，測定的濃度分別為

9、28.29±2.39(μg/μl)和29.31±2.51(μg/μl)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.413，P>0.05)。 2.2D—DIGE的檢測率 經(jīng)DeCyder軟件分析平均檢測率為1732(±43.92)個斑點(diǎn)。而同步進(jìn)行的三張Deep purple熒光染色制備膠也達(dá)到了近1700個斑點(diǎn)的檢測率。 3.2D—DIGE凝膠圖譜差異分析 運(yùn)用DeCyder V6.0軟件進(jìn)行膠內(nèi)分析，同時(shí)利用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行膠間分

10、析，獲得的凝膠間匹配率最低為82.7％，找出豐度差異大于1.5倍的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)35個，其中24個蛋白點(diǎn)表達(dá)顯著上調(diào)，11個蛋白點(diǎn)表達(dá)顯著下調(diào)。 4.質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)庫檢索 經(jīng)過MALDI—TOF—MS分析，獲得35個差異蛋白點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖譜PMF，其中30個PMF數(shù)據(jù)經(jīng)本地Profound檢索和在線Mascot檢索獲得到了一致的結(jié)果，將30個蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)與凝膠上相應(yīng)斑點(diǎn)的分子量和等電點(diǎn)對比基本符合，可認(rèn)為是成功鑒

11、定的蛋白質(zhì)，鑒定率達(dá)85.71％。其中23個蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，7個蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。多數(shù)蛋白點(diǎn)出現(xiàn)重復(fù)鑒定，但重復(fù)蛋白點(diǎn)相鄰，且強(qiáng)度變化趨勢一致，再次證明結(jié)果的可靠性。合并重復(fù)鑒定的蛋白，獲得的差異蛋白17種，其中11種為上調(diào)蛋白，6種為下調(diào)蛋白。分析其結(jié)構(gòu)和功能，可分為蛋白酶抑制劑、補(bǔ)體蛋白、免疫球蛋白、角質(zhì)素、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、未知功能蛋白六類。其中7種是首次發(fā)現(xiàn)，它們的功能與免疫、生長調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控等密切相關(guān)。 結(jié)論：