聚環(huán)氧乙烷對(duì)膿毒血癥休克大鼠脊斜肌微循環(huán)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 嚴(yán)重感染所致的感染性休克是當(dāng)前危重病醫(yī)學(xué)中首位死亡因素，醫(yī)療耗費(fèi)巨大。雖然近年來(lái)在抗生素的使用、重癥監(jiān)護(hù)、支持治療等方面有了極大發(fā)展，但近10年死亡率并未出現(xiàn)下降趨勢(shì)。嚴(yán)重感染與感染性休克時(shí)因缺氧和酸中毒致使微循環(huán)瘀滯，血漿外滲，致使有效循環(huán)血量減少，血流分布異常，同時(shí)炎癥代謝產(chǎn)物與內(nèi)毒素的直接損傷等可共同導(dǎo)致血壓下降與組織器官灌注減少，其中缺氧和酸中毒時(shí)上述病理改變更為明顯。微循環(huán)障礙和炎癥反應(yīng)是其重要病理生

2、理基礎(chǔ)，改善微循環(huán)和減輕炎癥反應(yīng)是影響預(yù)后的關(guān)鍵。持續(xù)的微循環(huán)惡化導(dǎo)致多器官功能衰竭，最終導(dǎo)致死亡。臨床感染性休克治療中，液體復(fù)蘇是恢復(fù)血液動(dòng)力學(xué)、組織/器官灌注的首要治療措施，但是經(jīng)過(guò)早期目標(biāo)治療后，即使容量已恢復(fù)，微循環(huán)的障礙仍可能繼續(xù)存在。所以尋找一個(gè)更加有效的改善微循環(huán)的治療方法迫在眉睫。早期研究發(fā)現(xiàn)，微循環(huán)成像越差的患者預(yù)后越差，微循環(huán)改善快的感染性休克患者存活率高于微循環(huán)改善慢的患者，在發(fā)生休克后盡早改善微循環(huán)將明顯改善死亡

3、率。
　　 Toms等于上世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)在流體中加入少量的高分子聚合物后，流動(dòng)阻力明顯降低，在不改變驅(qū)動(dòng)壓的情況下，流速增加。這種現(xiàn)象稱(chēng)為T(mén)oms效應(yīng)(Tomseffect)，而這種高分子聚合物稱(chēng)為減阻劑。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究報(bào)導(dǎo)減阻劑能夠阻止延緩動(dòng)脈粥樣硬化的形成，有延緩糖尿病微血管病變、利尿及改善腎功能，減少機(jī)械作用對(duì)紅細(xì)胞的機(jī)械損傷等。這些作用可能與以下幾種機(jī)制有關(guān)。1:降低“血漿撇清效應(yīng)(plasmaskimmingeffe

4、ct)”，紅細(xì)胞懸液在微血管里流動(dòng)時(shí)，在近管壁處會(huì)產(chǎn)生一個(gè)相對(duì)少細(xì)胞的區(qū)域，這種現(xiàn)象為“血漿撇清”，加入減阻劑可以顯著減少近管壁處的少紅細(xì)胞血漿層的厚度，使紅細(xì)胞重新分布于近管壁處，使得在動(dòng)脈及毛細(xì)血管中血液-氣體交換更便利;2:增加紅細(xì)胞變形能力，使其更容易通過(guò)微循環(huán);3:降低血漿流動(dòng)雷諾系數(shù)，使血漿流動(dòng)湍流減少，降低血管阻力;4:降低“法-林效應(yīng):(Farhaeus-Lindqvisteffect)”逆轉(zhuǎn)的臨界半徑可以使紅細(xì)胞在通過(guò)

5、更小的微循阻力降低從而增加紅細(xì)胞向局部組織供氧;
　　 自上世紀(jì)70年代減阻劑開(kāi)始應(yīng)用在醫(yī)學(xué)研究中，其主要作用是改善血流動(dòng)力學(xué)，近年來(lái)逐漸發(fā)現(xiàn)減阻劑在改善糖尿病動(dòng)物微循環(huán)障礙、急性心肌缺血?jiǎng)游锏念A(yù)后，失血性休克的再灌注及液體復(fù)蘇等方面都有一定的作用。國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)其在感染性休克微循環(huán)方面的研究。本研究擬建立大鼠膿毒血癥休克模型，通過(guò)顯微鏡直接觀察脊斜肌微循環(huán)變化，探究減阻劑對(duì)感染性休克大鼠骨骼肌微循環(huán)的影響。
　　 材料與

6、方法：
　　 1、藥品與試劑
　　 聚環(huán)氧乙烷50000（PEOSigma公司）;0.9％氯化鈉注射液（山東魯抗）;3％戊巴比妥鈉（南方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。
　　 2、儀器
　　 監(jiān)護(hù)儀(飛利浦MP60);微量輸注泵（德國(guó)貝朗）;纖維素膜透析袋(Spectrum公司);正置熒光顯微鏡(ZEISS公司)+NIS-ELEMENT軟件。3K30低溫離心機(jī)（美國(guó)sigma公司）;8453紫光-可見(jiàn)分光光度計(jì)美國(guó)A

7、gilent公司）;動(dòng)脈壓力傳感器;漩渦振蕩器MS3
　　 3、動(dòng)物
　　 雄性SPF級(jí)Wistar大鼠(南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供)48只，體重180～200g。
　　 4、方法
　　 4.1、減阻劑制備
　　 精確稱(chēng)取10mgPEO，加入10ml生理鹽水，配制成濃度為1000ppm的溶液。將配好的PEO溶液裝入分子截留量為40000Da的透析袋中，于生理鹽水中透析24小時(shí)。用生理鹽水將透析后的1

8、000ppm溶液稀釋為10ppm和50ppm存放于4攝氏度冰箱備用。
　　 4.2、動(dòng)物模型制備
　　 在對(duì)膿毒癥的研究中，人們通常采用注射致死量大腸桿菌、注射內(nèi)毒素脂多糖(LPS)及CLP等方法建立膿毒癥的動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)感染模型采用盲腸結(jié)扎穿刺法(CLP)來(lái)建立，
　　 CLP模型是研究感染及相關(guān)疾病最常用的模型，是膿毒血癥實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕饦?biāo)準(zhǔn)，能夠比較真實(shí)的模擬感染的病理生理過(guò)程。此模型采用結(jié)扎盲腸末端并穿刺的

9、方法，使腸內(nèi)容物及菌群轉(zhuǎn)移入血并引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)。方法:體重180-200g雄性大鼠，3％戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉，固定，備皮消毒。無(wú)菌手術(shù)。下腹部正中切口2cm，找出盲腸末端，結(jié)扎中下1/3處，（見(jiàn)圖1）注意勿損傷血管。14號(hào)針頭穿透并擠出少許腸內(nèi)容物，保證穿孔穿通。（見(jiàn)圖2）注意勿損傷腸系膜和血管?；丶{腸管，勿使扭轉(zhuǎn)避免梗阻，消毒切口縫合。術(shù)畢蘇醒后放回觀察，有膿毒血癥休克表現(xiàn)后進(jìn)行試驗(yàn)。每只動(dòng)物手術(shù)操作和時(shí)間盡量保持一

10、致，以使試驗(yàn)時(shí)模型感染程度盡量一致。在本研究中，CLP后大鼠逐漸出現(xiàn)萎靡、躁動(dòng)、豎毛、腹瀉等表現(xiàn);處死動(dòng)物后剖腹見(jiàn)腹腔有血性或膿性滲出液，帶惡臭，腸管脹氣，內(nèi)臟充血水腫失去原有光澤;表明動(dòng)物模型的復(fù)制是成功的。
　　 4.3、試驗(yàn)動(dòng)物外科準(zhǔn)備
　　 動(dòng)物有休克表現(xiàn)后（統(tǒng)一14小時(shí)后）。腹腔注射戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉后，固定并暴露右側(cè)腹股溝，右側(cè)股動(dòng)脈切開(kāi)穿刺插管，連接動(dòng)脈測(cè)壓裝置，持續(xù)監(jiān)測(cè)動(dòng)脈平均壓。靜脈插管進(jìn)

11、行補(bǔ)液。暴露背部皮膚，分離脊斜肌并將脊斜肌置于顯微鏡下觀察微循環(huán)血流，持續(xù)滴入平衡液保持脊斜肌表面濕潤(rùn)。間隔進(jìn)行錄像采集局部微循環(huán)圖像。
　　 4.4、模型分組及數(shù)據(jù)采集
　　 模型隨機(jī)分為4組，聚環(huán)氧乙烷低劑量組（PE01組）持續(xù)泵入生理鹽水+10ppm聚環(huán)氧乙烷，聚環(huán)氧乙烷高劑量組（PE02組）持續(xù)泵入生理鹽水+50ppm聚環(huán)氧乙烷，生理鹽水對(duì)照組（NS組）持續(xù)泵入單純生理鹽水。復(fù)蘇時(shí)間為4小時(shí)，速度均為15ml/k

12、g/h，空白對(duì)照組（NT組）不進(jìn)行液體復(fù)蘇，復(fù)蘇結(jié)束后縫合創(chuàng)口觀察生存時(shí)間。在復(fù)蘇開(kāi)始前(T0)以及開(kāi)始后10分鐘(T10)，30分鐘(T30)，60分鐘(T60)，120分鐘(T120)和240分鐘(T240)記錄微循環(huán)狀態(tài)。并在開(kāi)始復(fù)蘇前，復(fù)蘇結(jié)束后和存活72小時(shí)后采集血液測(cè)乳酸濃度并留存血清標(biāo)本檢測(cè)炎癥因子和肝腎功能。血清保留方法:血漿抗凝后3000r/min離心10分鐘取上清-80°冰箱保存。
　　 4.5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理<

13、br>　　 數(shù)據(jù)全部采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以(x)±s表示;組內(nèi)前后對(duì)比采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，組間比較采用One-WayNAOVA，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)以LSD方法，P＜0.05為差異有顯著性。圖表使用SPSS13.0和office2007制作。
　　 結(jié)果：
　　 1、對(duì)心率和血壓的影響。
　　 除NT組血壓逐漸下降，在復(fù)蘇結(jié)束時(shí)低于其余三組（p＜0.05），其余各組間血壓心率均無(wú)明顯變化。

14、
　　 2、對(duì)大鼠脊斜肌小動(dòng)脈管徑和紅細(xì)胞流速的影響。
　　 四組在復(fù)蘇前后及各組間比較血管管徑并無(wú)顯著變化，所測(cè)量血管的直徑為37.20±7.75(μm)。RBC流速PE01組給藥后顯著增快，10分鐘時(shí)即達(dá)到峰值（2228.93±292.86vs3115.70±375.95p=0.000），其后持續(xù)給藥可維持穩(wěn)定，速度有所下降但不顯著，復(fù)蘇結(jié)束時(shí)明顯快于復(fù)蘇前(2228.9±292.9vs2759.7±215.7p=0

15、.001)。PE02組給藥后RBC流速同樣顯著加快，之后迅速下降致復(fù)蘇前水平，并不能維持。NS組RBC流速減慢但不顯著(p＞0.05)。NT組則持續(xù)下降，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(T240)顯著低于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)(T0)(p=0.004)。各組間相比，在給藥10分鐘后PE01組.PE02組RBC流速快于NS組和NT組(p＜0.05)，PE02組在給藥60分鐘后速度下降至NS組和NT組水平(p＞0.05)，而PE01組則維持較快的RBC流速至復(fù)蘇結(jié)束。NS

16、組間各時(shí)間點(diǎn)RBC流速無(wú)明顯差異。而NT組結(jié)束時(shí)則要低于其余3組（p＜0.05）。
　　 3、大鼠血漿IL-6、TNF-α和血乳酸濃度變化以及復(fù)蘇4小時(shí)乳酸清除率。
　　 血乳酸濃度除NT組復(fù)蘇前后無(wú)明顯變化，其余三組復(fù)蘇后乳酸濃度均明顯低于復(fù)蘇前（p＜0.01），組間相比復(fù)蘇后PE01組，PE02組和NS組三組血乳酸濃度均明顯低于NT組（p＜0.05），相應(yīng)的乳酸清除率也明顯高于NT組（p＜0.05）。PE01組復(fù)蘇后

17、血乳酸濃度比NS組和PE02組稍低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而乳酸清除率是明顯高于NS組和PE02組(p＜0.05)表1。而血漿IL-6和TNF-α濃度組間和組內(nèi)比較均無(wú)明顯變化（p＞0.05）
　　 4、大鼠最終生存時(shí)間變化。
　　 每組12只大鼠納入實(shí)驗(yàn)，PE01組72小時(shí)后存活5只，存活率為41.7％。NS組72小時(shí)后有2只存活，存活率為16.7％。PE02組僅有一只存活，存活率為8.3％。而NT組則沒(méi)有一直存活超過(guò)48小

18、時(shí)。平均生存時(shí)間PE01組53±5.7小時(shí)明顯長(zhǎng)于NT組的26±4.1小時(shí)和NS組的34±5.8小時(shí)。而PE02組為37±4.8小時(shí)，和NS組無(wú)明顯差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.低濃度(10ppm)聚環(huán)氧乙烷能夠加速血乳酸的清除，降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)乳酸濃度，改善膿毒血癥休克大鼠預(yù)后，顯著提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存時(shí)間。
　　 2.低濃度(10ppm)聚環(huán)氧乙烷對(duì)微循環(huán)管徑?jīng)]有影響，能夠顯著提高膿毒血癥休克大鼠脊斜肌微循環(huán)血流