紅曲多糖高產(chǎn)菌株的誘變篩選及其提取純化免疫活性研究.pdf

1、本論文旨在通過小白鼠試驗(yàn)給出紅曲多糖的毒理特征和對提高機(jī)體免疫力的作用。并通過UV誘變紅曲霉篩選紅曲多糖的高產(chǎn)菌株，優(yōu)化其液體發(fā)酵條件。研究了影響紅曲多糖提取率和純化程度的主要因素。通過一系列試驗(yàn)，初步給出了紅曲多糖的理化性質(zhì)、分子量、結(jié)構(gòu)、以及組成成分等。 首先對紅曲霉斜面培養(yǎng)基進(jìn)行了研究，通過試驗(yàn)確定了麥芽汁糖化工藝，確定了斜面培養(yǎng)基：麥芽汁糖度6-8.5波美度，pH6-7，2％瓊脂。 正常灌胃紅曲多糖21天后，稱量

2、小鼠體重，并將肝、脾、腎、心、肺分別稱重，計(jì)算臟體指數(shù)。結(jié)果可以看出，紅曲多糖能增加肝臟質(zhì)量，增加脾臟質(zhì)量，而高濃度又降低脾質(zhì)量，對其他各個(gè)器官無明顯的不良影響。而且從SGPT含量來看，紅曲多糖能顯著降低其含量，而對血糖含量和SGOT含量影響不明顯。結(jié)論是紅曲多糖對小鼠無明顯的毒害作用。 通過DTH試驗(yàn)，小鼠經(jīng)灌胃紅曲多糖后，其足跖腫脹度與對照組差異明顯，說明紅曲多糖能提高小鼠細(xì)胞免疫功能。在三氯甲烷致中毒試驗(yàn)中，和對照組相比，

3、試驗(yàn)組SGPT含量有所降低說明紅曲多糖有保肝護(hù)肝作用。碳粒廓清試驗(yàn)，給小鼠灌胃紅曲多糖，能使廓清速率大幅增加表明紅曲多糖可提高腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力，促使小鼠外周血E-玫瑰環(huán)形成，增加體內(nèi)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，使非特異性免疫加強(qiáng)。游泳試驗(yàn)和耐缺氧能力試驗(yàn)似乎說明紅曲多糖在提高機(jī)體耐疲勞能力和缺氧條件下生活能力方面作用不大，有待進(jìn)一步研究。 利用紫外線對出發(fā)菌株紅曲霉AS3.4701進(jìn)行誘變處理，經(jīng)過初篩確定了最佳誘變劑量：254nm，2

4、.0min。再經(jīng)過復(fù)篩獲得了一株最佳突變株ZH-100，該突變株經(jīng)連續(xù)三次傳代，結(jié)果紅曲粗多糖的產(chǎn)量分別是4.26g/L，4.69g/L，4.10g/L，平均4.35g/L。證明該菌株具有穩(wěn)定的遺傳性，比出發(fā)菌株提高產(chǎn)量286％。 通過三組試驗(yàn)，包括：(1)發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)；(2)無機(jī)元素的含量確定的平行試驗(yàn)；(3)優(yōu)化的發(fā)酵條件驗(yàn)證試驗(yàn)。得出結(jié)論：紅曲霉在經(jīng)過斜面培養(yǎng)后，以大米漿為基礎(chǔ)培養(yǎng)物(固形物10％)，加入NaNO

5、30.15％，MgSO4·7H2O0.15％，KH2PO40.25％，溫度35℃，220r/min搖床培養(yǎng)96小時(shí)，再經(jīng)4000r/min離心5min，24小時(shí)醇沉，電熱鼓風(fēng)干燥等操作，產(chǎn)多糖量5.53g/L，高出初始條件27％。 通過正交試驗(yàn)優(yōu)化得最佳提取條件為：浸提溫度90℃；浸提料液比1：3；浸提時(shí)間30min。紅曲多糖的產(chǎn)量為6.66g/L，高出初始條件20％。 利用苯酚-硫酸法測得紅曲粗多糖中總糖含量為78％；

6、利用3.5-二硝基水楊酸法測定還原糖含量為12.5％；則多糖含量65.5％。利用考馬斯亮藍(lán)法測定可溶蛋白含量為5.2％。 通過試驗(yàn)確定了紅曲粗多糖的純化工藝，Sevag法除雜蛋白，透析帶除鹽及小分子物質(zhì)，SephadexG-200柱層析，收集峰值的糖，冷凍干燥得紅曲多糖純品。 紙層析上只有一個(gè)海藍(lán)色斑點(diǎn)，表明紅曲多糖是單一純物質(zhì)。確定了展開劑為正丁醇-乙醇-水(12：3：5)。SephadexG-200柱層析呈單洗脫峰表

7、明多糖組分均一。 通過一系列生化試驗(yàn)，紅曲多糖粗品為淺紅色粉末，純品為白色粉末，較易溶于水，水溶液粘稠，pH6左右，無色無味，1％的紅曲多糖水溶液粘度460mPa.s，與碘試劑不呈藍(lán)色。苯酚-硫酸反應(yīng)呈桔紅色，蒽酮試劑反應(yīng)呈藍(lán)綠色，比旋光度[α]20D=1.66。不溶于高濃度乙醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。 本試驗(yàn)采用雙向薄層層析方法，紅曲多糖經(jīng)2mol/L硫酸水解，展開劑氯仿：甲醇：水=16：9：2，對紅曲多糖的

8、組分進(jìn)行了測定，基本確定了紅曲多糖中含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖。 采用SephadexG-200進(jìn)行凝膠過濾層析，上樣量5mg/1m1，0.1mol/LNaCl溶液洗脫，利用已知分子量的葡聚糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定紅曲多糖分子量為31.6萬。 紅外光譜IR分析：將2mg紅曲多糖純品與200mg純KBr研細(xì)混合均勻在油壓機(jī)上壓成透明薄片，在TJ270-30紅外分光光度計(jì)上IR分析，掃描范圍4000-400cm-1，得出紅曲多糖是