人糞便中Vimentin基因甲基化分析在大腸癌早期診斷中的意義.pdf

1、背景：
　　 大腸癌是人類最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，包括結(jié)腸癌和直腸癌。從全球來看，大腸癌的發(fā)病率和死亡率在持續(xù)升高。每年全世界有超過100萬的大腸癌患者被確診，且在全世界惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率中，其發(fā)病率占第三位，死亡率占第四位。在西方發(fā)達(dá)國家，盡管其檢測技術(shù)，手術(shù)和化療技術(shù)較先進(jìn)，大腸癌在惡性腫瘤的死亡率中占第二位。我國大腸癌的發(fā)病率雖低于西方國家，近年來隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨

2、勢。2006年國家衛(wèi)生部的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國大腸癌死亡率已位居惡性腫瘤第五位，其發(fā)病率在40歲開始上升，至60-75歲時(shí)達(dá)高峰。預(yù)防結(jié)腸癌已經(jīng)成為一個(gè)很大的、時(shí)有爭議的、公共健康問題。
　　 腺瘤是散發(fā)性大腸癌最主要的癌前病變。據(jù)估計(jì)約50％以上的人會有大腸腺瘤，但僅有6％的腺瘤可發(fā)展為大腸癌。雖然大多數(shù)腺瘤并未發(fā)展為大腸癌，我們?nèi)孕枰獙ζ溥M(jìn)行篩查，特別是很有可能發(fā)展為大腸癌的腺瘤，也稱為進(jìn)展期腺瘤。進(jìn)展期腺瘤是指腺瘤大小≥1c

3、m或低分化腺瘤或有絨毛成分的腺瘤，是大腸癌的高危因素，需嚴(yán)密篩查。因此，有必要對普通人群進(jìn)行篩查和對高危人群進(jìn)行監(jiān)視。
　　 眾所周知，惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因作用的多階段過程。大量研究表明，有一套特定基因的改變導(dǎo)致并推動了大腸癌的發(fā)生發(fā)展。染色體不穩(wěn)定性、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、表觀遺傳學(xué)改變等為大腸癌的主要發(fā)生機(jī)制。由基因轉(zhuǎn)錄沉默所引起的表觀遺傳學(xué)改變是大腸癌的發(fā)生機(jī)制之一，表觀遺傳(epigenetics)學(xué)是指不涉及基因組

4、DNA序列改變而在細(xì)胞分裂過程中可以遺傳給子代細(xì)胞的基因組修飾作用，目前最為人們所知的表觀遺傳學(xué)主要方式是DNA甲基化。由于DNA甲基化往往發(fā)生在大腸癌發(fā)生過程中的早期，很容易在患者的糞便中檢測到。因此，檢測糞便中DNA甲基化狀態(tài)有望成為大腸癌篩查和早期無創(chuàng)診斷的一條新途徑。
　　 Vimentin是中間絲纖維蛋白家族的一員，在很多方面表現(xiàn)出復(fù)雜的基因表達(dá)模式。主要表達(dá)于胚胎組織和由間葉組織來源的成體細(xì)胞。越來越多的研究已經(jīng)表明

5、，Vimentin的表達(dá)并非是間充質(zhì)起源細(xì)胞及向間葉分化的腫瘤細(xì)胞的特異性生物標(biāo)志。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)角蛋白和Vimentin在乳腺癌、肝細(xì)胞肝癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、食管癌、結(jié)腸癌、肺癌等上皮源性惡性腫瘤中的共同表達(dá)，而且與癌細(xì)胞的侵襲性強(qiáng)和易轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。另有研究證實(shí)，與腫瘤、癌前病變（如腺瘤）產(chǎn)生相關(guān)的Vimentin的表達(dá)下調(diào)可能與其啟動子的甲基化密切相關(guān)。這提示DNA甲基化可以從基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)Vimentin的表達(dá)，其對于腫瘤

6、細(xì)胞遷移具有促進(jìn)作用。Chen等研究顯示未發(fā)生轉(zhuǎn)移的早期大腸癌組織和晚期大腸癌的Vimentin基因的甲基化率是相等的，還有研究表明Vimentin基因甲基化與腫瘤大小和Duke's分期無關(guān)，這些都說明Vimentin基因甲基化檢測對大腸癌早期診斷的重要性。
　　 目的：
　　 本文應(yīng)用甲基化特異性PCR(MSP)技術(shù)分析了60例大腸癌患者、17例大腸腺瘤患者及30例正常對照者糞便中Vimentin基因甲基化狀態(tài)，并對同

7、一份糞便標(biāo)本用免疫化學(xué)法進(jìn)行糞便隱血試驗(yàn)檢測，以比較和評估Vimentin基因甲基化作為大腸癌早期診斷中的可行性和臨床意義。
　　 資料和方法：
　　 糞便標(biāo)本取自2009年5月至2010年8月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的大腸癌、腺瘤患者和門診行結(jié)腸鏡檢查的病人，所有標(biāo)本均經(jīng)內(nèi)鏡病理證實(shí)。60例大腸癌患者中，男37例，女23例，男女比例為1.6:1，年齡范圍為23～82歲，平均年齡63.4歲；17例大腸腺瘤的患者中，男12

8、例，女5例，男女比例為2.4:1，年齡范圍為28～76歲，平均年齡58.2歲。另選擇30例年齡匹配的健康人為正常對照組，全結(jié)腸鏡檢查結(jié)果均為全結(jié)腸粘膜未發(fā)現(xiàn)異常。正常對照組中男15例，女15例，男女比例為1：1，年齡范圍為32～79歲，平均年齡為59.4歲。有炎癥性腸病、其他癌癥病史和主要心里疾病的患者均未被納入本研究中。糞便標(biāo)本于術(shù)前或內(nèi)鏡檢查前收集，收集后立即送至試驗(yàn)室，分裝后置-70℃冰箱保存。所有患者住院或門診檢查時(shí)均用免疫化學(xué)

9、法檢測糞便潛血。對糞便標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，后用QIAamp DNA Stool Minikit(Qiagen，德國)試劑盒提取DNA，提取出的DNA保存在200ul的AE緩沖液中，并放置于-20℃的冰箱中。然后再按照EpiTect BisulfiteKit(Qiagen，德國)試劑盒操作說明書進(jìn)行DNA的亞硫酸氫鹽修飾和純化，放置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。重亞硫酸氫鹽修飾后的DNA作為MSP的模板檢測Vimentin基因甲基化狀態(tài)。
　

10、　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法，各組間率的比較采用x2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法檢驗(yàn)。檢驗(yàn)結(jié)果以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1在60例大腸癌患者的糞便標(biāo)本中，有31例(51.67％)檢測出Vimentin基因甲基化，有13例(21.67％)糞便隱血檢測陽性。Vimentin基因甲基化檢測診斷大腸癌的敏感性(51.67％)與糞便隱血試驗(yàn)的敏感性(21.67

11、％)相比較，x2=11.6268，P=0.000＜0.05。
　　 2在17例大腸腺瘤患者的糞便標(biāo)本中，有4例(23.53％)檢測出Vimentin基因甲基化，1例(5.88％)糞便隱血檢測陽性。Vimentin基因甲基化檢測診斷大腸腺瘤的敏感性(23.53％)與糞便隱血試驗(yàn)的敏感性(5.88％)相比較，P=0.3353＞0.05。
　　 3 Vimentin基因甲基化狀態(tài)改變與大腸癌患者的性別、年齡、腫塊大小沒有明顯的

12、相關(guān)性(P＞0.05)。
　　 4 Vimentin基因甲基化狀態(tài)改變與大腸腺瘤患者的腺瘤大小、發(fā)生部位無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。
　　 5 Vimentin基因甲基化狀態(tài)改變在左半結(jié)腸癌和右半結(jié)腸癌的發(fā)生率分別為60.98％和31.58％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=4.493，P=0.034);在Dukes分期A、B和C、D期中發(fā)生率分別為82.14％和25％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=19.5265，P=0.000)

13、。
　　 6 Vimentin基因甲基化檢測對大腸癌和大腸腺瘤的特異性均為100％，糞便隱血試驗(yàn)的特異性為96.7％。
　　 結(jié)論：
　　 1甲基化特異性PCR檢測糞便中Vimentin基因甲基化狀態(tài)改變是大腸癌篩查和早期診斷的簡便、可行的方法。
　　 2 Vimentin基因甲基化狀態(tài)改變與大腸癌患者的性別、年齡、腫塊大小、腫瘤組織分化無明顯相關(guān)性。
　　 3 Vimentin基因甲基化狀態(tài)改變