百合離體授粉與原生質體培養(yǎng)的研究.pdf

1、本試驗以東方百合“索蚌Sorbonne”、“元帥Acapulca”和亞洲百合“頂級High Class”為試材，進行了在露地和離體條件下百合自交和雜交的授粉試驗、胚囊發(fā)育與雙受精過程細胞學觀察、原生質體培養(yǎng)幾方面的研究。探討了不同授粉方法克服百合不親和性的效果、離體授粉試驗的條件方法、胚囊發(fā)育與雙受精的時期、分離和培養(yǎng)原生質體的條件。 試驗結果表明，無論是親和組合還是不親和組合，花粉都可以在柱頭萌發(fā)，花粉管沿著花柱壁向下延伸，花

2、粉管量是按照柱頭，花柱，子房依次遞減的。切割花柱授粉能克服百合的花柱不親和性，通過離體授粉和子房切片結合的方式，可以克服索蚌自交在露地條件下授粉的不親和性。無論是采用常規(guī)柱頭授粉方式還是保留0.5花柱授粉方式，通過熒光染色觀察花粉管生長情況，露地授粉的花粉管生長速度略快于離體情況，但兩者差異不大。 通過八種正交試驗培養(yǎng)基的培養(yǎng)及結果分析選擇出有利于索蚌離體授粉子房培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方：MS+NAA0.02 mg·L<'-1>+糖8％

3、+BA0.2 mg·L<'-1>+氨基酸，或MS+NAA0.02mg·L<'-1>+糖8％+BA2 mg·L<'-1>+氨基酸。方差分析表明，影響最顯著的因子是授粉方式，依次順序為：糖、氨基酸、BA。從結種方面比較，索蚌自交離體條件下授粉的子房經(jīng)過子房切片培養(yǎng)、胚搶救的處理，最終得到7胚／子房，而在活體情況下子房在植株上栽培2個月后，并未得到有胚的種子。但百合遠緣雜交授粉在離體和活體兩種條件下都沒有得到種子。 離體胚珠授粉試驗中

4、觀察到，索蚌與頂級百合進行自交和正反交，其花粉都能正常進入胚珠的珠孔處，不親和的障礙不存在于花粉穿入珠孔處。花粉最早在2h左右萌發(fā)，花粉管進入珠孔最早發(fā)生在3-5h最遲在8-12h，DAPI染色后熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，最早生殖細胞分裂是培養(yǎng)13h后，13-17h花粉管分裂形成3核細胞最多的階段，22h后大部分花粉管內的物質都已經(jīng)釋放出來。授粉的胚珠初期生長膨大，但培養(yǎng)50-60d后胚珠萎蔫，變黃，沒有得到有胚的種子。 在觀察胚囊發(fā)

5、育，花粉管生長和雙受精過程的試驗中，百合大孢子的發(fā)育形式為貝母型，其胚囊發(fā)育最終形成育性正常的7細胞胚囊，-2級的胚囊已經(jīng)發(fā)育成熟，適宜授粉受精。異花授粉后花粉管3-5天到達胚囊，并釋放出兩個精核進行雙受精。百合胚胎發(fā)育經(jīng)過合子、原胚、球形胚、子葉型最終發(fā)育成熟。胚乳發(fā)育與胚胎同步，其屬于核型胚乳，在形成球形胚后胚乳細胞逐漸形成細胞壁。授粉后45天左右進行胚搶救較好。 本試驗還對百合原生質體的分離和培養(yǎng)進行研究，用混合酶液提取“

6、索蚌”百合的幼葉和愈傷組織的原生質體，對影響原生質體提取得率因素進行分析，用液體淺層培養(yǎng)法和固液結合培養(yǎng)在MS、改良MS和NLN培養(yǎng)基附加不同濃度6-BA，2,4-D等進行培養(yǎng)。試驗結果表明：纖維素酶和酶解時間對原生質體提取得率有極顯著影響，最適合百合幼葉原生質體提取的酶液組合為：2％Cellulase R-10，0.5％MacerozymeR-10，酶解4h。百合愈傷組織的原生質體提取的酶液混合液組合為：2％Cellulase R-1