大蒜原生質(zhì)體融合與培養(yǎng)技術(shù)研究.pdf

1、試驗于2008-2010年在山東農(nóng)業(yè)大學科技創(chuàng)新園和農(nóng)業(yè)部園藝作物重點開放實驗室進行。研究探討了大蒜鱗莖愈傷組織誘導的影響因素，利用獲得的胚性愈傷組織建立了懸浮細胞系，在此基礎(chǔ)上研究了原生質(zhì)體分離、純化的影響因素，并初步開展了原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合研究。主要研究結(jié)果如下：
　　 1研究表明2，4-D在大蒜愈傷組織誘導及繼代培養(yǎng)中起關(guān)鍵作用。MS+2，4-D2㎎/L+6-BA1㎎/L利于大蒜愈傷組織的產(chǎn)生，MS+NAA1㎎/L+6-B

2、A0.1㎎/L是適宜于愈傷組織增殖和芽分化的最佳培養(yǎng)基。無激素的培養(yǎng)基利于生根；繼代2次的愈傷組織的芽分化能力最強。高濃度的生長素有利于大蒜愈傷組織的誘導，但并不利于其分化。
　　 2影響大蒜組織培養(yǎng)的因素：（1）外植體類型：分別以大蒜鱗芽基部、中部、頂部為外植體誘導愈傷組織。基部和中部誘導胚性愈傷組織的最佳培養(yǎng)基MS+2，4-D2㎎/L+6-BA0.5㎎/L。MS+2，4-D1.5㎎/L為鱗芽頂部愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基，誘導

3、率為78.3％。（2）大蒜品種：蘇聯(lián)蒜，蒼山蒜和金蒜3號三種基因型中以蒼山蒜的出愈率最高，為78.12％，明顯高于蘇聯(lián)蒜、金蒜3號。（3）培養(yǎng)基類型：三種類型培養(yǎng)基中以MS培養(yǎng)基的出愈率（82.35％）最高，與B5培養(yǎng)基（68.09％）和1/2MS（62.50％）差異顯著。
　　 3以胚性愈傷組織為材料，建立了胚性懸浮細胞系。胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基時，不同基因型大蒜品種建立穩(wěn)定的懸浮細胞系所需時間相差不大。細胞個數(shù)基本成S型

4、變化。懸浮培養(yǎng)階段細胞鮮、干重的測定結(jié)果表明，培養(yǎng)前期細胞生長速度快，并于第16d達到峰值。
　　 4從懸浮細胞系、胚性愈傷組織、組培葉片分離得到原生質(zhì)體。繼代5d的大蒜懸浮細胞系是原生質(zhì)體分離的最佳材料，其次是愈傷組織，而從組培苗葉片分離的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力最低。以懸浮細胞系為分離材料的酶液組成為：2.0％Cellulase Onozuka R-10（纖維素酶）+0.2％PectolgaseY-23（果膠酶）+0.55 mol

5、/L甘露醇+5mM MES+10mM Cacl2（pH5.8）。分離大蒜懸浮細胞系原生質(zhì)體宜采用低速（90rpm）恒溫（25±1）℃搖床振蕩酶解，時間為5h。純化時，1000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min，能收集到大量有活力的原生質(zhì)體。適當提高離心力的短時間離心有利于原生質(zhì)體純化過程中產(chǎn)量和活力的保持。
　　 5原生質(zhì)體培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)：采用液體淺層培養(yǎng)的培養(yǎng)效果最好，培養(yǎng)基成分為：1/2MS+1㎎/L2.4-D+0.5㎎/L6-BA