Genistein對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的防治作用與機(jī)理研究.pdf

1、研究背景
　　乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者由于轉(zhuǎn)移灶骨組織結(jié)構(gòu)的破壞而出現(xiàn)劇烈骨痛、病理性骨折、高鈣血癥和神經(jīng)壓迫等癥狀,嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量,但其確切機(jī)理尚不清楚。目前的研究多集中于探討乳腺癌細(xì)胞致破骨細(xì)胞(osteoclast,OC)活性的增加,但單純抑制OC活性并不能完全阻止溶骨性損傷的進(jìn)展。近年有研究發(fā)現(xiàn),乳腺癌細(xì)胞還可能影響到骨微環(huán)境中的其他細(xì)胞尤其是成骨細(xì)胞(osteoblast,OB)的生物學(xué)功能,刺激OB活性也可能是乳腺癌骨轉(zhuǎn)

2、移臨床干預(yù)的一個(gè)重要作用靶點(diǎn)。乳腺癌及其骨轉(zhuǎn)移的臨床處理頗為棘手,由于內(nèi)分泌治療存在副作用和耐藥性,有關(guān)選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(selectiveestrogenreceptormodulator,SERM)和雌激素天然替代品在乳腺癌輔助治療及預(yù)防骨轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用受到了廣泛關(guān)注。5,7,4'-三羥基異黃酮(genistein,又稱染料木黃酮或金雀異黃酮)是植物雌激素的重要活性成分,能與雌激素受體(estrogenreceptor,ER)結(jié)

3、合產(chǎn)生雌激素樣效應(yīng)而無(wú)其副作用,有抗腫瘤、抗氧化、在正常骨組織代謝中促進(jìn)骨形成并抑制骨吸收等作用,但在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移等病理情況下是否也能調(diào)節(jié)骨代謝、緩解乳腺癌骨轉(zhuǎn)移所致的骨丟失,尚需深入研究。
　　研究目的
　　采用乳腺癌骨轉(zhuǎn)移裸鼠模型,預(yù)防或治療性給予Genistein進(jìn)行干預(yù),觀察其對(duì)裸鼠骨轉(zhuǎn)移灶形成和發(fā)展、骨量、骨組織結(jié)構(gòu)、OB和OC生物學(xué)功能的影響。同時(shí),采用體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞,探討具備不同轉(zhuǎn)移特性的人乳腺癌細(xì)胞對(duì)成骨細(xì)

4、胞生物學(xué)功能的影響和作用靶點(diǎn),以及Genistein對(duì)乳腺癌介質(zhì)中生長(zhǎng)的OB生物學(xué)功能影響的調(diào)控。從動(dòng)物水平和細(xì)胞水平探討Genistein對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的防治作用及其相關(guān)機(jī)理,為改變臨床單純抑制OC活性的治療措施,緩解和預(yù)防乳腺癌骨轉(zhuǎn)移時(shí)發(fā)生的骨丟失提供理論依據(jù)和新的干預(yù)思路。
　　研究方法
　　采用左心室注射人源性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞建立乳腺癌骨轉(zhuǎn)移裸鼠模型,預(yù)防或治療性給予Genistein進(jìn)行干預(yù)。實(shí)

5、驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)行裸鼠活體x光顯像計(jì)數(shù)骨轉(zhuǎn)移灶數(shù)量并測(cè)量腫瘤體積,收集血標(biāo)本后處死裸鼠,取骨標(biāo)本行脫鈣和不脫鈣切片,抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistantacidphosphatase,TRAP)染色法觀察OC活性,Goldner-Trichrome三色法觀察并測(cè)量骨量和骨結(jié)構(gòu)變化,自動(dòng)生化分析儀測(cè)量血清鈣、磷和堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)水平,探討Genistein對(duì)裸鼠骨轉(zhuǎn)移灶的形成和發(fā)展,

6、以及乳腺癌骨轉(zhuǎn)移病理?xiàng)l件下對(duì)骨量和骨結(jié)構(gòu)、OB和OC活性的影響作用。
　　同時(shí),采用源于大鼠顱蓋骨的原代OB進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),將OB與ER(-)的MDA-MB-231細(xì)胞或ER(+)的MCF-7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(conditionedmedium,CM)共同培養(yǎng),MTT法觀察條件培養(yǎng)基對(duì)OB增殖的影響,PNPP法觀察條件培養(yǎng)基對(duì)OB堿性磷酸酶活性的影響,茜素紅S(alizarinredS,ARS)進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)染色并計(jì)算面積觀察條件培養(yǎng)

7、基對(duì)OB礦化能力的影響,RT-PCR法分析條件培養(yǎng)基對(duì)OB骨相關(guān)基因BGP、OPG和RANKL表達(dá)水平的影響,以分析具備不同轉(zhuǎn)移特性的人乳腺癌細(xì)胞對(duì)OB生物學(xué)功能的可能影響作用和作用靶點(diǎn)。同時(shí),在條件培養(yǎng)基體系中加入不同濃度的Genistein進(jìn)行干預(yù),進(jìn)一步從細(xì)胞層面探討Genistein在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的病理?xiàng)l件下,對(duì)OB生物學(xué)功能的影響及可能作用機(jī)制。
　　結(jié)果
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:左心室接種了MDA-MB-231乳腺

8、癌細(xì)胞后21天,裸鼠經(jīng)全身X線骨掃描顯示多個(gè)部位有溶骨性骨轉(zhuǎn)移灶形成,尤其多見(jiàn)于四肢。而預(yù)防性(接種乳腺癌細(xì)胞前7天或接種同時(shí))給予Genistein進(jìn)行干預(yù),可不同程度地減少骨轉(zhuǎn)移灶數(shù)目和腫瘤體積,并減少TRAP染色陽(yáng)性的OC數(shù)目,并可顯著增加骨小梁面積(Tb.Ar％)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁個(gè)數(shù)(Tb.N),減少骨小梁分離度(Tb.Sp),證明Genistein對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移灶的形成和骨轉(zhuǎn)移所致的骨量丟失和骨結(jié)構(gòu)破壞均有較

9、好的預(yù)防作用。即使在骨轉(zhuǎn)移灶形成后(接種后21天并經(jīng)全身X線骨掃描證實(shí))治療性給予Genistein干預(yù),仍能明顯減少骨轉(zhuǎn)移灶數(shù)目和腫瘤體積的增加,并減緩骨轉(zhuǎn)移所致的骨量丟失和骨結(jié)構(gòu)損傷。同時(shí),Genistein可部分逆轉(zhuǎn)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移時(shí)的高ALP血癥,并對(duì)血鈣、血磷代謝失衡有一定修復(fù)作用。
　　體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基均可使OB發(fā)生纖維細(xì)胞形態(tài)改變,表現(xiàn)為細(xì)胞突起和突起連接減少,并可明顯抑

10、制OB的增殖:與培養(yǎng)基對(duì)照組(vehiclemedium,VM)比較,加入50％來(lái)自MDA-MB-231或MCF-7細(xì)胞的CM后1d、3d、5d和7d,抑制率分別為18.1％、13.0％、19.2％、19.3％和15.8％、20.8％、33.9％、28.7％,且差異均有顯著意義(P＜0.01)。此外,CM可明顯下調(diào)OB的ALP活性,并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,尤其是加入50％的CM后,對(duì)ALP活性的抑制作用分別達(dá)31.9％和47.5％(P＜0.

11、01)。CM對(duì)OB的礦化結(jié)節(jié)形成能力也有明顯抑制作用,隨著加入CM濃度的增加,形成的礦化結(jié)節(jié)面積明顯減少,尤其是加入50％MDA-MB-231或MCF-7的CM培養(yǎng)后,OB形成的礦化結(jié)節(jié)面積分別減少89％和74％(P＜0.01),即OB礦化結(jié)節(jié)形成能力幾乎被完全抑制。同時(shí),乳腺癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基可明顯下調(diào)骨相關(guān)基因BGP和OPG的表達(dá),上調(diào)RANKL基因的表達(dá)。而采用5×10-7mol/L、5×10-8mol/L和5×10-9mol/L的

12、Genistein干預(yù)后,OB增值率和ALP活性較單純條件培養(yǎng)基組有不同程度的提高,OB的ALP活性分別較MDA-MB-231和MCF-7條件培養(yǎng)基對(duì)照組增加22.7％、32.4％、63.5％和27.7％、32.0％、58.3％(P＜0.05)。Genistein還可改善乳腺癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)OB礦化能力的抑制,增加OB形成的礦化結(jié)節(jié)面積,并上調(diào):BGP、OPG基因表達(dá),下調(diào)RANKL基因表達(dá)。
　　結(jié)論
　　Geniste

13、in可抑制溶骨性骨轉(zhuǎn)移灶的形成和發(fā)展,部分逆轉(zhuǎn)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移所致的過(guò)度骨吸收、骨量丟失和骨結(jié)構(gòu)損傷,對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療均有一定作用。同時(shí),具備不同轉(zhuǎn)移特性的人乳腺癌細(xì)胞均可抑制OB的增殖和礦化形成能力,下調(diào)ALP活性,即可能通過(guò)調(diào)節(jié)OB功能致骨形成減少。而Genistein可改善乳腺癌細(xì)胞對(duì)OB生物學(xué)功能的抑制作用,即可直接促進(jìn)OB的增殖、分化和礦化能力,上調(diào)骨相關(guān)基因BGP和OPG的表達(dá)并下調(diào)RANKL基因的表達(dá),可能是Geni