Galectin-9在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其在腫瘤轉(zhuǎn)移中作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的： ①比較galectin-9在正常大腸上皮組織和結(jié)直腸癌組織的表達(dá)以及galectin-9的表達(dá)和結(jié)直腸癌臨床特征的關(guān)系。 ②研究galectin-9在大腸癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制及三種亞型(即galectin-9L，galectin-9M和galectin-9S)可能存在的功能差別。 方法： ①分別用real-timePCR和免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)20例正常大腸上皮組織和45例結(jié)直腸癌組織gal

2、ectin-9基因和蛋白的表達(dá)，比較galectin-9在正常大腸上皮組織和結(jié)直腸癌組織的差異表達(dá)并分析galectin-9的表達(dá)和結(jié)直腸癌臨床特征的關(guān)系。 ②用RT-PCR方法擴(kuò)增galectin-9三種剪接體的全長(zhǎng)片段，分別將片段連接到質(zhì)粒載體pIRES2-EGFP上，經(jīng)測(cè)序證實(shí)插入片段正確后，載體轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞，再用RT-PCR和Westernblot方法證實(shí)轉(zhuǎn)染效果。 ③用RT-PCR和Westernbl

3、ot方法比較分別轉(zhuǎn)染galectin-9不同亞型真核表達(dá)載體后某些侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子如integrin-β1，E-cadherin，E-selectin，ICAM-1，CD44和MMP-9在LoVo細(xì)胞表達(dá)的變化。 ④觀察分別轉(zhuǎn)染galectin-9不同亞型對(duì)LoVo細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞體外粘附實(shí)驗(yàn)、LoVo細(xì)胞-基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)以及LoVo細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)的影響。 ⑤篩選穩(wěn)定表達(dá)galectin-9不同亞型的LoVo細(xì)胞并進(jìn)行相關(guān)

4、的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果： ①real-timePCR結(jié)果顯示20例正常結(jié)直腸上皮組織中g(shù)alectin-9基因相對(duì)表達(dá)量為45.34±43.81，45例結(jié)直腸癌組織中g(shù)alectin-9基因相對(duì)表達(dá)量為19.80±17.37，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，galectin-9在正常結(jié)直腸上皮組織中表達(dá)的陽(yáng)性率為90％(18/20)，在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的陽(yáng)性率為62％(28/45)，差異同樣

5、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023)。galectin-9在基因和蛋白水平的低表達(dá)和結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)(P＜0.05)，和結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度、腫瘤分期及腫瘤部位無(wú)關(guān)。 ②成功構(gòu)建galectin-9三種亞型的真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo細(xì)胞。RT-PCR和Westernblot方法證實(shí)LoVo細(xì)胞分別表達(dá)galectin-9三種亞型。 ③轉(zhuǎn)染galectin-9L后

6、LoVo細(xì)胞E-selectin表達(dá)降低，轉(zhuǎn)染galectin-9M或galectin-9S后LoVo細(xì)胞E-selectin表達(dá)升高，半定量結(jié)果顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。分別轉(zhuǎn)染galectin-9不同亞型表達(dá)載體后，LoVo細(xì)胞integrin-βl，E-cadherin，ICAM-1，CD44和MMP-9的基因表達(dá)無(wú)變化。 ④轉(zhuǎn)染galectin-9M或galectin-9S后LoVo細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞體外黏附作

7、用增強(qiáng)。轉(zhuǎn)染空載體組和轉(zhuǎn)染galectin-9L組平均熒光強(qiáng)度分別為：0.90±0.20和0.94±0.24，轉(zhuǎn)染galectin-9M和galectin-9S組平均熒光強(qiáng)度分別為：1.60±0.11和1.45±0.13，后兩組與前兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。分別加入galectin-9抗體(10μg/ml)，E-selectin抗體(20μg/ml)和β-乳糖(30mM)后，各組間熒光強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染gale

8、ctin-9各個(gè)亞型后LoVo細(xì)胞與Matrigel的黏附作用增強(qiáng)。轉(zhuǎn)染空載體組平均吸光度為0.74±0.04，轉(zhuǎn)染galectin-9L，galectin-9M和galectin-9S組平均吸光度分別為：1.14±0.12，1.12±0.10和1.15±0.13，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。加入galectin-9抗體(10μg/ml)或β-乳糖(30mM)后該黏附作用被抑制，但E-selectin抗體(20μg/ml)不能抑制

9、該作用。同時(shí)，轉(zhuǎn)染galectin-9L組和轉(zhuǎn)染galectin-9S組被β-乳糖抑制作用較轉(zhuǎn)染galectin-9M組更明顯(P＜0.05)。體外侵襲實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)galectin-9三種亞型對(duì)LoVo細(xì)胞侵襲力有影響。 ⑤可篩選出穩(wěn)定表達(dá)galectin-9L的LoVo細(xì)胞，但無(wú)法篩選出穩(wěn)定表達(dá)galectin-9M或galectin-9S的LoVo細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)提示轉(zhuǎn)染galectin-9M或galectin-9S的Lo

10、Vo細(xì)胞的晚期凋亡率/壞死率大于轉(zhuǎn)染galectin-9LLoVo細(xì)胞的晚期凋亡率/壞死率。 結(jié)論： ①galectin-9在結(jié)直腸癌中低表達(dá)，并且和結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，有可能成為判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后的一種新型標(biāo)志物和結(jié)直腸癌基因治療的潛在靶點(diǎn)，但其三種亞型在其中發(fā)揮的作用需進(jìn)一步區(qū)分。 ②galectin-9不同亞型對(duì)LoVo細(xì)胞E-selectin的表達(dá)具有不同調(diào)節(jié)作用，即galectin-9L下調(diào)E-s

11、electin表達(dá)，galectin-9M和galectin-9S上調(diào)E-selectin表達(dá)。 ③galectin-9M或galectin-9S能促進(jìn)LoVo細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞體外黏附，galectin-9L未表現(xiàn)出這種作用，可能和galectin-9M和galectin-9S上調(diào)E-selectin表達(dá)而galectin-9L下調(diào)E-selectin表達(dá)有關(guān)。 ④galectin-9三種亞型均能促進(jìn)LoVo細(xì)胞與細(xì)胞外基