日本沼蝦微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)、遺傳結(jié)構(gòu)分析及性別相關(guān)遺傳標(biāo)記篩選研究.pdf

1、日本沼蝦隸屬十足目、長臂蝦科、沼蝦屬，自然分布于中國、日本、越南及俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)，在我國各地淡水水域中都有分布。日本沼蝦的養(yǎng)殖始于二十世紀(jì)五十年代，從2004年起，我國日本沼蝦的年養(yǎng)殖產(chǎn)量就超過了20萬噸。多年來，日本沼蝦在市場上一直供不應(yīng)求，暢銷不衰，是一種養(yǎng)殖效益非常可觀的淡水蝦類。但長期以來，繁殖日本沼蝦用的親本多為野生個體，未經(jīng)過系統(tǒng)選育，日本沼蝦的養(yǎng)殖單產(chǎn)較低，且多是套養(yǎng)在各種魚類的養(yǎng)殖池塘中，主養(yǎng)日本沼蝦的池塘較少。因此開展

2、日本沼蝦的種質(zhì)資源保護(hù)、良種選育工作是當(dāng)前日本沼蝦養(yǎng)殖業(yè)中亟待解決的問題。由于當(dāng)前已知的日本沼蝦微衛(wèi)星標(biāo)記只有二十多個，這嚴(yán)重地限制了日本沼蝦的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、種質(zhì)資源評價等工作;此外，日本沼蝦雄性生長速度顯著大于雌性，開展單性苗種培育意義重大，但當(dāng)前沒有鑒別日本沼蝦遺傳性別的分子標(biāo)記，使得單性苗種培育工作一直無法得以開展。本論文的研究內(nèi)容主要包含如下3個方面:
　　1.日本沼蝦多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā):
　　(1) FIA

3、SCO法開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記。通過生物素標(biāo)記的探針(GT)13和(GA)13富集微衛(wèi)星序列，共獲得含微衛(wèi)星的序列334個，成功設(shè)計(jì)引物110對，設(shè)計(jì)引物的序列含有的微衛(wèi)星重復(fù)多為2堿基重復(fù)，重復(fù)數(shù)多數(shù)在10次以上。設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增的目的條帶大小在95-356 bp之間。多態(tài)性分析顯示，24對引物擴(kuò)增出的條帶為清晰穩(wěn)定的多態(tài)，開發(fā)效率（多態(tài)性引物占總設(shè)計(jì)引物的百分比）為21.8％。各位點(diǎn)等位基因數(shù)介于2-9之間，各等位基因的大小范圍在111-33

4、4bp之間;各位點(diǎn)期望雜合度(He)在0.1905-1.0000之間，各位點(diǎn)的觀測雜合度(Ho)在0.1765-0.8090之間，除個別位點(diǎn)外(X781、X63、Z339)期望雜合度（Ho）與觀測雜合度（Ho）均在0.3以上;各等位基因的多態(tài)信息含量(PIC)在0.1574-0.8272之間，其中X781與Z339兩個位點(diǎn)的PIC值在0.25以下，屬于低度多態(tài)性位點(diǎn);X195等5個位點(diǎn)的PIC值在0.25與0.5之間，屬于中度多態(tài)性位點(diǎn)

5、;其余的17個位點(diǎn)的PIC值皆大于0.5，屬于高度多態(tài)性位點(diǎn)。經(jīng)Bonferroni法校正(P＜0.003)后，24個多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)中有9個微衛(wèi)星位點(diǎn)偏離了Hardy-Weinberg平衡，其中有2個位點(diǎn)(X1214、Z167)表現(xiàn)出顯著的雜合子缺失(Hardy-Weinberg平衡偏離指數(shù)D＜0，D=(Ho-He)/He），其他7個位點(diǎn)表現(xiàn)出顯著的雜合子過剩(Hardy-Weinberg平衡偏離指數(shù)D＞0)。
　　(2) IS

6、SR-PCR法開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記。設(shè)計(jì)的8對簡并引物中用于擴(kuò)增CA/GT重復(fù)單元的引物PCA6、PGT6、PTG6、PAC6能夠擴(kuò)增出亮度較大的彌散帶，將這四對簡并引物克隆后測序。將前人已經(jīng)開發(fā)出的微衛(wèi)星同源序列去除后，共獲得含微衛(wèi)星的序列114個，成功設(shè)計(jì)引物45對。多態(tài)性分析顯示，23對引物擴(kuò)增條帶為多態(tài)，開發(fā)效率為51.1％。各位點(diǎn)等位基因數(shù)介于2-12之間;各等位基因的大小范圍在141-324bp之間;各位點(diǎn)期望雜合度(He)在0.

7、2357-1.0000之間，各位點(diǎn)的觀測雜合度(Ho)在0.3203-0.9169之間;各等位基因的多態(tài)信息含量(PIC)在0.2894-0.8877之間，其中4個位點(diǎn)(B78、B96、B75、D30) PIC值在0.25-0.5之間，屬于中度多態(tài)位點(diǎn)，其他位點(diǎn)的PIC值都大于0.5，屬于高度多態(tài)位點(diǎn)。經(jīng)Bonferroni法校正(P＜0.003)后，23個多態(tài)性位點(diǎn)中6個微衛(wèi)星位點(diǎn)偏離了Hardy-Weinberg平衡，其中有三個位點(diǎn)

8、(B96、B73、B92)表現(xiàn)出顯著的雜合子缺失(Hardy-Weinberg平衡偏離指數(shù)D＜0，D=(Ho-He)/He)，另外三個位點(diǎn)(A89、B75、C2)表現(xiàn)出顯著的雜合子過剩（Hardy-Weinberg平衡偏離指數(shù)D＞0）。
　　(3)微衛(wèi)星序列特征分析
　　對391條含微衛(wèi)星重復(fù)的序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（圖3-7），發(fā)現(xiàn)獲得的微衛(wèi)星序列長度范圍在60-852 bp之間，100 bp以下的最少（16個）。大部分克隆片段

9、大小在200bp以上，占總序列的83.1％。日本沼蝦的微衛(wèi)星序列中以二核苷酸重復(fù)最為豐富，占所有微衛(wèi)星序列類型數(shù)目的92.4％，其次是三核苷酸(1.8％)或四核苷酸重復(fù)(1.6％)。二核苷酸重復(fù)中以(CA/GT)n類型所占比例最高，占總微衛(wèi)星序列數(shù)的68.3％，其次是（GA/CT）n型，占25.1％，此外還有少量的(TA/AT)n型和(GC/CG)n型，分別占2.8％和0.6％。
　　2.4個日本沼蝦群體遺傳結(jié)構(gòu)分析
　　利

10、用8個微衛(wèi)星標(biāo)記(A28、A73、B13、B29、B44、B93、D7、Z337)對太湖、東平湖、微山湖、長江下游（崇明島附近水域）4個群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，4個群體中長江下游（崇明島附近水域）群體的平均等位基因數(shù)最多，為13.5000，其次是微山湖群體為12.2500，太湖群體最低為11.87。微山湖群體的平均期望雜合度和觀測雜合度最高，分別為0.8403和0.8350;長江下游（崇明島附近水域）群體的最低，分別為0.7145和0.

11、7909。
　　各群體間遺傳距離分析顯示，微山湖和東平湖群體的遺傳距離最小，為0.0158;長江下游（崇明島附近水域）和微山湖的遺傳距離最大為0.3844。各群體間的遺傳相似度分析也得出了類似的結(jié)果，微山湖和東平湖的遺傳相似度最大(0.9162);長江下游（崇明島附近水域）和微山湖的遺傳相似度最小(0.6312)?；谶z傳距離的NJ和UPGMA聚類分析得到了相同的結(jié)果，東平湖群體和微山湖群體遺傳距離最小首先聚類為一支，再與太湖群體

12、聚為一支，最后和長江下游（崇明島附近水域）群體聚類為一支。聚類分析的情況和實(shí)際的地理距離相符。
　　4個日本沼蝦群體的分子方差分析（AMOVA）顯示，群體中89.29％的變異來源于個體內(nèi)，僅有4.18％的變異來源于群體間，6.52％來源于群體內(nèi)個體間，顯著性檢驗(yàn)分析顯示這4個群體遺傳分化極顯著(P＜0.01)。4個群體兩兩間遺傳分化指數(shù)Fst從0.0031到0.0739，其中東平湖群體與長江下游（崇明島附近水域）群體、微山湖群體與

13、長江下游（崇明島附近水域）群體的0.05＜Fst＜0.15，屬于中等分化程度;其他群體間的Fst值均＜0.05，分化程度較弱。
　　日本沼蝦群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析對其種質(zhì)資源保護(hù)和合理挖掘利用具有重要意義。
　　(3)性別相關(guān)標(biāo)記的篩選:
　　在利用15雌和15雄日本沼蝦對開發(fā)的47個微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性分析時，我們發(fā)現(xiàn)有8個SSR標(biāo)記出現(xiàn)了雌性或雄性特異的等位基因。為此，我們合成了這8個微衛(wèi)星標(biāo)記的上游熒光引物，利用熒光

14、SSR法，對另外的15雌和15雄日本沼蝦進(jìn)一步進(jìn)行分析、驗(yàn)證。結(jié)果顯示，有7個微衛(wèi)星標(biāo)記檢測到了雌性或雄性特異的等位基因（等位基因出現(xiàn)次數(shù)在2次以上）。
　　首先利用2個雌性個體和2個雄性個體對64對AFLP引物的擴(kuò)增情況進(jìn)行了篩選，對其中的9對引物進(jìn)一步利用15個雌性個體和15個雄性個體進(jìn)行大量分析。有8對檢測到分布頻率雌雄差異顯著的等位基因，其中雄性占絕大多數(shù)(90.9％)的等位基因有1個，雌性占絕大多數(shù)(84.6％)的等位基