基于虛擬篩選的天然抗氧化活性成分的研究.pdf

1、本論文發(fā)展了一種研究抗氧化活性成分的新篩選模式：針對一些與生物氧化、生物自由基反應(yīng)相關(guān)的酶，采用虛擬篩選方法，對所建立的天然小分子(源自多種藥食兩用中藥)化合物庫進(jìn)行篩選，以此為引導(dǎo)，對所篩選出的潛在抗氧化活性的天然化合物，采用本論文所建立的抗氧化HPLC測定方法進(jìn)行準(zhǔn)確驗證，從而便于從大量化合物樣本中快速發(fā)現(xiàn)真正的抗氧化活性成分。具體內(nèi)容如下：
　　 1、建立了一個包含376個天然化學(xué)成分的小分子庫，選擇了5個與生物氧化、生物

2、自由基反應(yīng)相關(guān)的酶(LOX-5、LOX-3、Cu/ZnSOD、GPx-1和XOD)，作為靶標(biāo)與小分子庫對接。對虛擬篩選的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)對上述5個靶點虛擬篩選評分排序前50位的化合物總共94個，其中一些化合物已有文獻(xiàn)活性數(shù)據(jù)支持。上述94個化合物中，對5個靶點均具有較強理論活性的化合物有17個：salvianolicacidB、chebulinicacid、sennosideB，isoginkgetin、forsythosideA

3、、echinacoside，cistanosideA、bilobetin、isoacteoside、lobetyolin、benzoylpaeoniflorin、polydatin、sesamolin、neohesperidin、astragaloside、kaempferol-3-O-rutinoside、sesamin。
　　 2、針對常規(guī)抗氧化分析所采用分光光度法易受非目標(biāo)產(chǎn)物干擾、準(zhǔn)確度、靈敏度較低的缺點，本論文建立了3

4、種新的基于HPLC的體外抗氧化活性檢測方法，分別為：
　　 (1)HPLC測定抗氧化劑對脂氧合酶的抑制率
　　 利用大豆脂氧合酶的特異性催化能力，以亞油酸為底物，經(jīng)酶促反應(yīng)產(chǎn)生亞油酸氫過氧化物(LA-OOH)。通過HPLC分析反應(yīng)體系中加或不加待測樣品時LA-OOH峰面積的變化，測得樣品對脂氧合酶的抑制率，以此衡量樣品的抗氧化活性。色譜條件是：采用辛基鍵合相硅膠色譜柱，以甲醇-水(55:45)為流動相，檢測波長為234n

5、m。
　　 (2)HPLC測定抗氧化劑對羥自由基的清除率
　　 利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，羥自由基與二甲亞砜反應(yīng)生成甲醛(HCHO)，甲醛經(jīng)2，4-二硝基苯肼(DNPH)衍生后生成腙(HCHO-DNPH)，通過HPLC分析反應(yīng)體系中加或不加待測樣品時HCHO-DNPH峰面積的變化，測得樣品的羥自由基清除率，以此衡量樣品的抗氧化活性。色譜條件是：采用十八烷基硅烷鍵合相硅膠色譜柱；以乙腈-水(65:35)為流動相，檢

6、測波長為365nm。
　　 (3)HPLC測定抗氧化劑對脂質(zhì)過氧化的抑制率
　　 利用Fe2+誘導(dǎo)卵黃脂質(zhì)產(chǎn)生過氧化物，并進(jìn)而生成丙二醛(MDA)，用2-硫代巴比妥酸(TBA)與丙二醛反應(yīng)生成復(fù)合物(MDA-FBA)，通過HPLC分析反應(yīng)體系中加或不加待測樣品時MDA-TBA峰面積的變化，測得樣品的脂質(zhì)過氧化抑制率，以此衡量樣品的抗氧化活性。色譜條件是：采用十八烷基硅烷鍵合相硅膠色譜柱，以乙腈-水-冰醋酸(24:76:0

7、.5)為流動相；檢測波長為532nm。
　　 3、結(jié)合本實驗室獲得的化合物樣品實際情況，以LOX-3為代表性靶點，從虛擬篩選結(jié)果中選擇了虎杖苷(polydatin)、白藜蘆醇(resveratrol)和綠原酸(chlorogenicacid)三個化合物進(jìn)行體外抗氧化活性驗證，其結(jié)果如下：
　　 (1)對脂氧合酶的抑制作用?；⒄溶諏OX-3的抑制作用最強，IC50為41.28μg/ml；綠原酸IC50為149.6μg/m

8、l；白藜蘆醇IC50>80μg/ml。這一結(jié)果與虛擬篩選的結(jié)果基本吻合，表明虛擬篩選結(jié)果較為可靠。
　　 (2)清除羥自由基的能力。白藜蘆醇的清除能力最強，其次為虎杖苷，最后是綠原酸，其IC50分別為4.53μg/ml、19.21μg/ml和27.59μg/ml。
　　 (3)抑制脂質(zhì)過氧化。白藜蘆醇對脂質(zhì)過氧化具有較強的作用，IC50為6.83μg/ml；虎杖苷抑制脂質(zhì)過氧化的IC50為21.53μg/ml；綠原酸抑制