gli3，enl基因在單純性馬蹄內(nèi)翻足發(fā)生中的功能研究

1、篷 H E R E D I T A S( B e i j i n g ) 2 0 0 9 年 1 2 月， 3 1 ( 1 2 ) ： 1 2 1 4 -1 2 2 0I S S N0 2 5 3 - 9 7 7 2W W W ． c h i n a g e n e ． c a研 究報(bào)告 DoI ： 1 0 ． 3 7 2 4 ／ S P． J ． 1 0 0 5 ． 2 0 0 9 ． 0 1 21 4G L I 3 ， E N 1基

2、 因在單純性馬蹄 內(nèi)翻足發(fā)生中的功能研究 曹東華一 ， 王謙 ， 林長坤 ，王正東 ，張炫 ， 金春蓮 1 ．中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ) 醫(yī)學(xué) 院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室， 沈 陽 l 1 0 0 0 1 ；2 ．中國人 民解放軍第二零二 醫(yī)院檢驗(yàn)科，沈陽 1 1 0 0 0 3摘 要：為 了探討人類 G L I 3 基 因在單純性馬蹄內(nèi)翻足( I d i o p a t h i cc o n g e n i t a lt a l i p e se

3、q u i n o v a r u s ， I C T E V ) 發(fā)生時(shí)所 起 的作用 ， 文 章構(gòu) 建 了大 鼠 G l i 3 基 因啟 動(dòng)子 區(qū)域 熒光 素酶報(bào) 告基 因表達(dá) 載體來 分析 G l i 3 基 因啟 動(dòng)子的 活性，并利用 P — Ma t c h 軟件 預(yù)測 大 鼠 G l i 3 基 因啟 動(dòng)子 區(qū)域可 能 的調(diào) 控元件 ， 應(yīng)用 C h I P實(shí)驗(yàn) 加 以驗(yàn)證 。并利用 R T - P C R 、免疫組 化和

4、 We s t e r nb l o t t i n g的方 法分析 大 鼠 E n l與 I C T E V的相 關(guān)性 。 經(jīng) P — Ma t c h軟件 預(yù)測， G l i 3 基 因啟 動(dòng)子 區(qū)域有 3 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子E n l 的可能結(jié)合位點(diǎn)， 經(jīng) C h I P 實(shí)驗(yàn)證實(shí)位 點(diǎn)1 是真正結(jié)合位點(diǎn)。 R T - P C R、 免疫組化和 We s t e r nb l o t t i n g 方 法都 證 實(shí) E n l 基 因在

5、 馬蹄 內(nèi)翻足模 型 鼠 中表達(dá) 下 降。 結(jié)果提 示 大 鼠的轉(zhuǎn)錄 因子 E n l 可能是 G l i 3基 因的上游 負(fù)調(diào) 控元件 。 在 I C T E V 患者 中， 很 可能是 由于 E N 1 基 因表 達(dá)水 平的下 降導(dǎo) 致 了 G L I 3 基 因表 達(dá)水 平 的上升，最終 導(dǎo)致 I C T E V 的發(fā) 生 。關(guān)鍵 詞： G L I 3 基因； E N 1 基 因；單純性馬蹄內(nèi)翻足 Thef un c t i o

6、n so fGLI 3a ndEN1g e ne si ni d i o p a t h i cc o n g e n i t a lt a l i pe se q u l n 0 V a r usC AODo n g — Hu a一， WANGQi a n， L I N C h a n g — Ku n， WANGZ h e n g — D o n g，Z HANG Xu a n， J I N Ch u n — Li a n1

7、． De p a r t me n t o fMe d i c a l Ge n e t i c s ， C h i n aMe d i c a l U n i v e r s i t y ， S h e n y a n g1 1 0 0 0 1 ， C h i n a ；2 ． N o ． 2 0 2H o s p i m lo f P e o p l e ’ sL i b e r a t i o n A r m y ， S h e

8、n y a n g1 1 0 0 0 3 ， C h i n aAb s t r a c t ： T oi n v e s t i g a t et h er o l eo fg e n eG l i 3i ni d i o p a t h i cc o n g e n i t a lt a l i p e se q u i n o v a r u s ( I C T E V) ， w ec o n s t r u c t e dt h

9、 eGl i 3l u c i f e r a s er e p o ge rg e n ee x p r e s s i o nv e c t o r st oa n a l y z et h ep r o mo t e ra c t i v i t yo ft h er a tg e n eGl i 3 ． T h er e g u l a t o r ye l e —me n ti nt h ep r o mo t e rr e

10、g i o no ft h er a tGl i 3wa sp r e d i c t e du s i n gP — M a t c hs o f t wa r ea n df u r t h e rv e r if i e db yCh I Pe x p e r ime n t ．M e a n wh i l e ， t h ec o r r e l a t i o nb e t we e nt her a tE ha n dI C

11、T EV wa se v a l u a t e db yR T _ PC R， i mm u n o h i s t o c h e mi s t r y , a n dW e s t e r n b l o t t i n ga n a ly s e s ． T h er e s u l tf r o m P — M a t c hs o f t wa r ep r e d i c t i o ns h o we d t h

12、a t o n l yo n eo ft h et h r e ep o s s i b l eEn lb i n d i n gs i t e si nGl i 3p r o mo t e rr e g i o nwa si nt e r a c t e dd i r e c t l ywi t hE nli nv i v o ，wh i c hwa sc o n f ir me db yCh I Pa n a ly s i s ．

13、T h er e s u l t sf r o m RT ． P CR， i mmu n o h i s t o c h e mi s t r ya n dWe s t e r nb l o t t i n ga n a ly s e ss u g g e s t e dt ha t 西 zwa sd o wn — r e g u l a t e di nI CT E V mo d e lr a t sc o mp a r e dt

14、ot h ec o n t r o l s ． Ou rr e s u l t si n d i c a t e dt ha t』mi g h tb et hen e g a t i v er e g u l a t o r ye l e me n ti nt heu p s t r e a m o fGl i 3 ． T h el o w e x p r e s s i o nl e v e lo f1 Ⅳi nI CTEV c

15、 o u l dc o n t r i b u t et ot h eu p — r e g u l a t i o no fGL． wh i c hl e dt ot heg e n e s i so fI CT EV．／ Ke y wo r d s ： G L I 3 ； E Ⅳ； i d i o p a t h i cc o n g e n i t a lt a l i p e se q u i n o v a r u s ( I

16、 C T E V )收稿 日期： 2 0 0 9 — 0 5 — 0 4 ；修 回 E l 期： 2 0 0 9 — 0 8 — 0 2基金項(xiàng) 目： 國家 自然科學(xué)基金項(xiàng) 目( 編號(hào) ：3 0 9 7 3 1 4 0 ) 資助 作者簡介： 曹東華( 1 9 7 4 一 ) ， 男， 主管技師， 博士研究生， 研究方向 ： 遺傳病 的分子遺傳學(xué)。T e l ： 1 3 0 1 9 3 3 3 2 6 6 ； E ． m a i l ： d

17、 h c a o 4 2 7 @s i n a ． c o m通訊作者： 金春蓮( 1 9 4 5 一 ) ， 女， 教授， 研究方 向：遺傳病的分子遺傳學(xué) 。T e l ： 0 2 4 — 2 3 2 5 6 6 6 6 — 5 3 2 4 ； E ． m a i l ： C h u n l i a n j i n @1 2 6 ． t o m1 2 1 6遺 H E R E D I T A S( B e i j i n g ) 2

18、0 0 9第 3 1 卷 劑 盒操作 步驟進(jìn) 行操作 。 實(shí) 驗(yàn)管加 入 8m gE n l 抗體 ，陰性對照管中加入 8m gS o x 9 抗體。 4 ~ C 搖床孵育過 夜 ，用 C h I P清 洗液清 洗 3遍 ， 6 5 ％反交聯(lián) 5h ， 離 心 取 上清，加 入蛋 白酶 K ，4 2 ％孵育 2h ，回收 DN A，以其為模 板進(jìn)行 P C R擴(kuò)增 。同時(shí) 以 I n p u tD N A為 模 板進(jìn)行 P C R擴(kuò)增，

19、 來驗(yàn)證胎鼠下肢中有無 G l i 3 基 因表 達(dá)；以大 鼠基 因組 D NA為模 板進(jìn)行 P C R擴(kuò)增 ，作 為 P C R實(shí) 驗(yàn) 陽性 對照 。 P C R體 系同 1 ． 2 ． 1 ，復(fù)性 溫度 為 5 9 ℃，復(fù)性 時(shí) 間為 1m i n ，預(yù) 期產(chǎn) 物分別 為 2 6 4b p ( 包含 E n l 預(yù)測位點(diǎn) 1 ) 和 2 3 7b p ( 包含 E n l 預(yù)測位 點(diǎn) 2 和 3 ) 。C h I P實(shí)驗(yàn)所用 P C

20、 R引物序列見表 1 。1 ． 2 ． 4I C T E V大鼠模型的建立 I C T E V大鼠模型的建立參照文獻(xiàn)[ 5 ] 。1 ． 2 ． 5E n l基 因的 R T — P C R檢 測 取孕 1 4dI C T E V模 型胎 鼠和正常對 照組 胎 鼠各 5只，按常規(guī) 方法 提取 下肢足 踝部組 織 總 R N A。嚴(yán) 格按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明反轉(zhuǎn)錄合成 c D N A ，以c DN A 為模板 ，以 ~ J - a c t

21、 i n 作 為 內(nèi)參 ，檢測 E n l基 因 的表達(dá) 情況 。P C R體 系 同 1 ． 2 ． 1 ，復(fù)性 溫度 為 5 9 ℃。E n l基 因預(yù)期產(chǎn) 物大小 為 2 5 5b p ，~ J - a c t i n預(yù)期 產(chǎn)物 大 小 為 3 8 9b p 。 產(chǎn) 物 經(jīng) 1 ． 5 ％瓊 脂 糖 膠 電泳 ，用 A l p h a I m a g e2 0 0 0自動(dòng)成像儀( A l p h aI n n o t e c hC

22、 o r p ． ，S a nJ o s e， C A) 攝 影，用 F l u o r c h e m v2 ． 0S t a n dAl o n e軟件分析 R T — P C R產(chǎn)量。經(jīng) t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。1 ． 2 ． 6 免 疫 組 化 取孕 1 4d 的 I C T E V模 型胎 鼠和正常對 照組 胎 鼠 各 5只。將胎鼠下肢用中性 甲醛固定， 并用石蠟包 埋切片。切片常規(guī)脫蠟入水， 嚴(yán)格按照試劑盒操作 規(guī)程 進(jìn)行

23、 免疫組 化實(shí) 驗(yàn) 。 E n l 主要 為細(xì)胞 質(zhì)染 色，陽 性細(xì)胞胞漿中存在棕黃色顆粒。每張切片選取 5個(gè) 視野， 每個(gè)視野計(jì)數(shù) 1 0 0個(gè)細(xì)胞， 計(jì)算陽性細(xì)胞發(fā)生 率 。經(jīng) t 檢驗(yàn)進(jìn) 行統(tǒng) 計(jì)分 析 。1 ． 2 ． 7W e s t e r nb l o t t i n g取孕 1 4dI C T E V模 型胎 鼠和正 常對 照組胎 鼠各 5只， 所有模型胎 鼠和正常對照胎 鼠下肢分別 收集 于一管， 嚴(yán)格按照蛋白提取試劑

24、盒 的操作要求提取 蛋 白。應(yīng)用 S D S — P A G E凝膠 電泳分離蛋 白質(zhì)， 電轉(zhuǎn) 至 P V DF膜 上 。3 ％ BS A 封 閉后 ，于 1 ：2 0 0稀 釋 的 E n l 抗體 孵育 3h ，再 用 1 ： 4 0 0 0 稀釋 的辣根 過氧 化物 酶標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育 2h ， E C L顯色。2 結(jié)果與分析 2 ． 1G ／ ／ 3 基因啟動(dòng)子區(qū)域依次截短熒光素酶報(bào)告基 因表 達(dá)載體 的構(gòu) 建及 活性 分析