α-地中海貧血及β-地中海貧血電化學基因傳感器基因分型試劑的研制.pdf

1、目的：
　　本研究采用電化學基因傳感器技術研制α-地中海貧血和β-地中海貧血電化學基因分型檢測試劑，能夠一次性簡便、快速地檢測中國人群常見的3種非缺失型α-地中海貧血點突變基因位點和12種常見的β-地中海貧血點突變基因位點。這15種點突變基因位點包括:
　　非缺失型α-地中海貧血點突變基因位點:αCS、αQS、αWS
　　β-地中海貧血點突變基因位點:-28(A＞G)、Cap+1(A＞C)、Int(ATG＞AGG)、C

2、D14-15(+G)、CD17(AAG＞TAG)、 CD26(GAG＞AAG)、CD27-28(+C)、CD31(-C)、CD41-42(-CTTT)、CD43(G＞T)、 CD71-72(+A)和IVS-Ⅱ-654(C＞T)。以此為α-地中海貧血和β-地中海貧血（簡稱α-/β-地貧）的臨床輔助診斷提供一種新的方法。
　　方法:
　?。ㄒ唬┑刂泻Ｘ氀娀瘜W基因傳感器的構建與優(yōu)化
　　1.捕獲探針與信號探針的設計與合成:

3、從NCBI基因數(shù)據(jù)庫中查找到地中海貧血α珠蛋白基因和β珠蛋白基因序列，針對3種非缺失型α-地中海貧血點突變基因位點和12種常見的β-地中海貧血點突變基因位點分別設計合成DNA捕獲探針和信號探針。且信號探針和捕獲探針序列為與α珠蛋白基因和β珠蛋白基因序列互補的鄰近序列。
　　2.電化學雜交模板的設計與合成:根據(jù)信號探針以及捕獲探針序列設計與兩條探針完全互補配對的序列，作為驗證地中海貧血基因電化學傳感器芯片的模板。
　　3.雜交

4、時間測試:使用點制好捕獲探針的電化學基因傳感器生物芯片，加入信號探針及雜交模板的雜交液，使雜交液覆蓋固定有特異性捕獲探針的PCB板上，將雜交模板與捕獲探針、信號探針的雜交時間設置為15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min和60min。采用電化學檢測儀檢測不同雜交時間內檢出的電化學信號值，通過雜交時間梯度實驗選出最佳雜交時間。
　　4.雜交溫度測試:選取根據(jù)設計的探針Tm值（45°左右）選擇

5、40℃～47℃的8個溫度作為待測雜交溫度，按前面得出的最佳雜交時間進行電化學雜交，后采用電化學檢測儀檢測不同雜交溫度下檢出的電化學信號值，通過雜交溫度梯度實驗選出最佳雜交溫度。
　　5.信號探針濃度優(yōu)化:通過Au-S鍵的形成，將濃度為6pmol/L S-S-ssDNA捕獲探針固定至金電極表面形成SAM。點制好捕獲探針的芯片通過清洗及組裝工藝組裝成電化學基因傳感器生物芯片。固定雜交模板濃度，信號探針濃度依次為1.5pmol/L、2.

6、5pmol/L、3.5pmol/L、4.5pmol/L、5.5pmol/L、6.5pmol/L、7.5pmol/L、8.5pmol/L、9.5pmol/L和10.5pmol/L，采用電化學檢測儀檢測不同信號探針濃度檢出的電化學信號值，通過信號探針濃度梯度實驗選出各個信號探針的最佳濃度。
　　（二）地中海貧血電化學基因傳感器PCR檢測方法的建立
　　1.引物的設計與合成:采用Primer Premier5.0軟件和Oligo6

7、軟件設計可以擴增目的片段的特異性引物HBA-F與HBA-R、HBB-1F與HBB-1R、HBB-2F與HBB-2R、HBB-3F與HBB-3R。其中HBA-F與HBA-R擴增1個α珠蛋白基因片段，HBB-1F與HBB-1R、HBB-2F與HBB-2R、HBB-3F與HBB-3R分別擴增3個β珠蛋白基因。
　　2.多重不對稱PCR擴增體系優(yōu)化:以野生型人全血基因組為模板，依次從單重對稱PCR擴增、單重不對稱PCR擴增到多重不對稱PC

8、R擴增進行引物用量測試，結合電泳及電化學檢測信號值兩個結果調整體系中引物用量，確定各對引物在整個多重不對稱PCR擴增體系中的最佳用量。
　?。ㄈ┑刂泻Ｘ氀娀瘜W基因傳感器基因分型的性能驗證
　　提取由三家三級甲等醫(yī)院收集的901例臨床全血樣本的基因組DNA，進行金標準測序的同時用前述業(yè)已建立的電化學基因傳感器檢測方法，對這些樣本中的15個地中海貧血基因位點進行定性檢測，最終檢測電化學檢測結果與測序結果的一致性進而驗證電化學

9、基因傳感器檢測方法的檢測能力及可靠性。
　　結果:
　?。ㄒ唬┑刂泻Ｘ氀娀瘜W基因傳感器的構建與優(yōu)化
　　捕獲探針與信號探針及電化學雜交模板設計成功后由進行上海生工生物(Sangon Biotech)公司合成。45min內，雜交時間的增加電化學信號值呈增高趨勢，但30min至45min的4個雜交時間中，信號值升高的幅度大幅下降，基于檢測時間和檢測信號最佳平衡考慮，我們將雜交時間設為30min。40口C，41℃和42℃條

10、件下，出現(xiàn)的非特異信號均較高，不利于后期結果的判斷，而44℃～47℃條件下，雖然幾乎非特異信號，但是本身信號值降低也十分明顯，最終確定雜交溫度為43℃。捕獲探針濃度固定為6pmol/L，固定雜交模板濃度，檢測二茂鐵信號探針濃度的線性范圍。當信號探針的濃度低于3.5pmol/L時，電化學信號值變化較小;當信號探針濃度大于3.5pmol/L時，電化學信號值開始明顯增加;信號探針濃度升到5.5pmol/L時，電化學信號值開始大幅度增高:而當信

11、號探針濃度大于8.5pmol/L時，電極的電化學信號值基本無太大變化，說明地中海貧血電化學基因傳感器檢測的線性范圍在一定程度上受二茂鐵信號探針濃度的影響，最終確定各個信號探針濃度為7pmol/L～8.5pmol/L之間。
　?。ǘ┑刂泻Ｘ氀娀瘜W基因傳感器PCR檢測方法的建立
　　引物設計成功后由進行上海生工生物(Sangon Biotech)公司合成。確定多重不對稱PCR反應體系為50μL，含10×buffer(TAKA

12、RA)5μL、dNTPs(25mmol/L)0.4μL、Betaine(5mmol/L)8μL、Hot start Taq酶(10U/μL)0.3μL、濃度為10pmol/L的上游引物HBA-F0.2μL，HBB-1F、HBB-2F、HBB-3F各0.1μL，濃度為10pmol/L的下游引物HBA-R、 HBB-1R、HBB-2R、HBB-3R各1μL，DNA模板2μL。確定PCR反應條件為94℃預變性15分鐘，然后按94℃45秒→58

13、℃30秒→72℃45秒擴增，35個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。
　?。ㄈ┑刂泻Ｘ氀娀瘜W基因傳感器基因分型的性能驗證
　　應用901例臨床樣本驗證地中海貧血電化學基因傳感器特性，除4例樣本由于本身質量問題提取失敗外，15種地中海貧血點突變基因位點均能被正確識別。與測序結果有極好的一致性。當靶DNA與相應的捕獲探針及不同二茂鐵標記的信號探針序列完全互補配對時，電極上相應氧化還原電位的電化學信號急劇上升;當探針與靶DNA互補

14、序列中存在單個堿基錯配時，相同信號探針濃度和靶DNA濃度下，存在錯配的序列其電化學信號值較完全互補序列小很多，甚至不產(chǎn)生電化學信號。因此，本實驗設計的地中海貧血電化學基因傳感器能準確地區(qū)分相應的基因型別。
　　結論:
　　通過對反應條件的優(yōu)化，以Thiol-Modifier C6 S-S標記探針為捕獲探針，二茂鐵標記探針為信號探針，基于堿基互補配對原理，通過夾心法構建的地中海貧血電化學基因傳感器基因分型試劑，用于檢測地中海貧