基因突變敏感性分子開關檢測β地中海貧血.pdf

1、目的：采用高保真DNA聚合酶介導的基因突變敏感性分子開關準確、快速檢測β地中海貧血基因突變。
　　方法：首先提取正常人血液基因組DNA，根據(jù)已知中國人群β珠蛋白基因熱點突變CD41-42、IVS-2nt654、TATAbox-28、CD17、CD71-72及 CD26區(qū)域序列，分別設計引入突變位點的擴增引物，利用低保真酶進行引物延伸反應，將其PCR產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體，得到β地中海貧血常見的六個突變位點的基因突變克?。篊D

2、41-42、IVS-2nt654、TATAbox-28、CD17、CD71-72及CD26。然后以這六個突變位點為檢測靶點，分別設計3’末端與野生型基因位點或突變型基因位點配對的引物，硫化磷酸修飾后偶聯(lián)高保真DNA聚合酶構成基因突變敏感性分子開關。首先在不同體系分別對含有相應突變位點的六個陽性質粒模板及正常人基因組DNA模板進行引物延伸反應，并通過凝膠成像系統(tǒng)對其進行分析；然后在同一體系中同時對含有相應突變位點的六個陽性質粒模板及正常人

3、基因組DNA模板進行引物延伸反應，并通過凝膠成像系統(tǒng)對其進行分析；最后對已知分別含有CD26和TATAbox-28突變位點的病人DNA樣本進行檢測。
　　結果：在不同反應體系分別對六個熱點突變進行檢測。結果顯示，使用正常人的染色體DNA樣本，該方法僅能使野生型等位基因相關引物得以延伸，而突變型等位基因位點特異性引物不能被延伸。反之，使用突變質粒模板，該方法僅能使突變型等位基因位點相關引物得以延伸，而野生型等位基因位點特異性引物不能

4、被延伸。在同一反應體系同時對以上熱點突變進行檢測。同樣，完全配對引物能被延伸，不完全配對引物不能被延伸。對分別含有CD26和TATAbox-28突變位點的病人DNA樣本進行檢測，與含CD26突變位點的病人DNA模板配對的突變引物有產(chǎn)物，不配對的無產(chǎn)物；與含TATAbox-28突變位點的病人DNA模板配對的突變引物有產(chǎn)物，不配對的無產(chǎn)物。
　　結論：
　　1.成功獲得可用于基因檢測技術研發(fā)的人工突變的地中海貧血基因突變陽性模板